张乔儒 孙皓然 彭章蓉 张海华 冯敏山* 张铁涛*
(1.河北科技师范学院动物科技学院，河北省特色动物种质资源挖掘与创新重点实验室，秦皇岛066004；
2.中国农业科学院特产研究所，长春130112)
我国宠物市场的2021年产值已达到2 200亿元，且近年宠物食品的需求量激增。然而，我国对于宠物食品原料评价的相关研究并不深入，准确评估饲料原料的有效能值可以更加合理地配制宠物食品。当前对于宠物食品有效能值的研究多以代谢能(metabolizable energy,ME)体系为主导，而净能(net energy,NE)体系在ME体系的基础上考虑了热增耗的损失，能够真实反映饲料有效能值[1]。蛋白质饲料原料作为宠物食品中最重要的组分，其质量直接影响宠物食品的品质。目前，在宠物食品中对于蛋白质饲料原料的评价多采用水貂[2]、切除盲肠公鸡[3]、回肠瘘管插管犬[4]等动物模型，但以上方法都不能完全反映饲料在动物体内被消化利用的情况[5]。体内法可以反映出动物最真实的消化情况，是当前评价饲料有效能值最准确的方法，具体可分为直接法与替代法。直接法以被测饲料作为唯一的能量来源，李德发[6]提出直接法仅限于对猪谷物类原料能值的测定，并且可能由于营养成分不均衡以及适口性等因素对动物的健康产生影响。替代法测定原料能值时，替代的比例会影响测定的准确性[7]，当替代比例大于20%时，可以得到较为准确的结果[8]。于明等[9]以15%的替代比例测定辽西驴常用精饲料的消化能(digestible energy,DE)。Huang等[10]、Kim等[11]均采用30%的替代比例测定猪饲料原料的有效能值。当前，国内外运用不同方法对宠物食品原料营养价值评价的研究鲜有报道。因此，本研究以鸡肉粉为待测原料，成年雌性比格犬为试验动物，通过直接法和替代法测定比格犬对鸡肉粉的营养物质表观消化率及有效能值，为比格犬在蛋白质饲料原料的评价提供方法学上的参考依据。
1.1 试验动物与试验设计
消化代谢试验与呼吸测热试验于中国农业科学院特产研究所左家比格犬试验基地进行。选用6只初始体重为(9.67±0.52) kg的12月龄健康状况良好的雌性比格犬。试验开始前注射犬用八联疫苗，根据其体重用阿苯达唑进行驱虫。采用5×6的不完全拉丁方设计，设置5个组，每组6个重复，每个重复1只犬。
1.2 试验饲粮
基础饲粮参照NRC(2006)[12]成年犬维持营养需要量配制，鸡肉粉购自烟台某动物营养公司。直接法为100%鸡肉粉饲粮(100%组)；
替代法饲粮分别为基础饲粮(0组)和3种试验饲粮，试验饲粮分别以15%、30%和45%的鸡肉粉替代基础饲粮，分别记为15%组、30%组和45%组。试验所用饲粮为粉料，饲粮组成及营养水平见表1。
表1 饲粮组成及营养水平(干物质基础)
续表1项目 Items鸡肉粉替代比例 Chicken meal substitution proportion/%1000153045代谢能 ME/(MJ/kg)20.9317.7618.1818.4018.62粗蛋白质 CP76.7024.2031.7938.0347.97粗脂肪 EE9.5511.6111.7211.0510.56粗灰分 Ash7.417.127.388.619.22碳水化合物 Carbohydrate2.4249.1341.2335.6924.88粗纤维 CF12.1610.9911.3111.7511.97钙 Ca0.380.840.790.710.84磷 P0.590.710.520.560.74
1.3 试验设计
试验分5期进行，每个试验期10 d，包括预试期3 d，正试期7 d。每批试验间隔7 d，期间饲喂基础饲粮。正试期中呼吸测热试验包括4 d的正常代谢试验(消化代谢试验同步进行)与3 d的绝食代谢试验。在试验开始前参照NRC(2006)[12]成年犬每日ME维持需要量确定采食量。每天饲喂900 g饲粮，09:00、14:00各喂450 g，试验饲粮料水比为1∶2(绝食代谢除外)，自由饮水。试验期间犬置于吉林省农业科学院研制的开放式呼吸测热仪中单独饲喂，该套装置连接6个呼吸测热室，室内有粪尿收集装置。正试期前4 d采用全收粪法收集粪、尿，每天记录犬只的排粪量、粪便评分，后3 d仅收集尿液，所有样品-20 ℃冷冻保存。分别记录正常代谢与绝食代谢的总尿量。在消化代谢试验结束后，将收集到的粪样混匀置于65 ℃烘箱中48 h至烘干，测定粪样概略养分含量及总能(gross energy,GE)。
1.4 测定指标
1.4.1 营养物质含量测定
饲粮、原料以及粪样中干物质(dry matter,DM)、粗脂肪(ether extract,EE)、粗蛋白质(crude protein,CP)、粗灰分(Ash)、粗纤维(crude fiber,CF)以及原料中的钙(calcium,Ca)和磷(phosphorus,P)含量测定依据《饲料分析及饲料质量检测技术》[13]进行；
GE与粪能(fecal energy,FE)参照ISO 9831:1998中推荐的方法，使用氧弹式热量测定仪(IKA C2000，德国)进行测定。粪便评分标准参考威豪粪便评分系统(Waltham®Faeces Scoring System，WFS)[14]，所有粪便样本使用5分制评分系统对粪便质量进行评估(1：干、硬、易碎，“子弹状”；
1.5：干、硬，按压时出现裂纹；
2：成形良好，捡拾起来不留印记；
2.5：成形良好，表面略湿，捡拾后留下印记；
3：含水量较多，不成形，捡拾后留下明显印记；
3.5：含水量很多，但基本成形；
4：基本不成形；
4.5：腹泻，部分区域有一点成形；
5：水样腹泻)。
1.4.2 尿能(UE)测定
取6张定量滤纸分别测定其能值，计算出滤纸的平均能值。将6 mL尿液分2次滴在滤纸上，经65 ℃烘干后使用氧弹式热量测定仪(IKA C2000，德国)测定，得到滤纸和尿液的GE值。计算公式如下：
UE(J/mL)=[滴加尿液后滤纸的GE值(J)-
滤纸的平均能值(J)×2]/6 (mL)。
1.5 计算公式
1.5.1 饲粮及原料营养物质表观消化率的计算
饲粮营养物质表观消化率(%)=100×
(食入的营养物质的量-排出的营养
物质的量)/食入的营养物质的量；
原料营养物质表观消化率(%)=[试验饲粮
营养物质表观消化率-(100-X)×基础饲粮中
营养物质的表观消化率]/X。
式中：X为待测原料在试验饲粮中所占的比例(%)。
1.5.2 饲粮能值
饲粮DE(MJ/kg)=[食入GE(MJ)-
FE(MJ)]/食入饲粮质量(kg)；
饲粮ME(MJ/kg)=[食入GE(MJ)-FE(MJ)-
UE(MJ)]/食入饲粮质量(kg)；
饲粮NE(MJ/kg)=[食入GE(MJ)-FE(MJ)-
UE(MJ)-总产热量(THP,MJ)+绝食产热量
(FHP,MJ)]/食入饲粮质量(kg)[15]。
1.5.3 替代法测定原料能值的计算公式
待测原料能值(MJ/kg DM)=[试验饲粮能值-
(100-X)×基础饲粮能值]/X。
式中：X为待测原料在试验饲粮中所占的比例(%)；
待测原料能值可以为NE、DE、ME。以上结果均以DM为基础[16]。
1.6 统计分析
试验数据采用Excel2021进行初步整理，使用SPSS 25.0软件中的one-way ANOVA程序进行方差分析，并采用Duncan氏法进行组间多重比较，P<0.05为差异显著。
2.1 直接法与替代法测定的比格犬饲粮营养物质表观消化率
由表2可知，100%组DM、OM、EE、CP、GE以及CF的表观消化率显著高于各替代法组(P<0.05)。30%组与45%组DM与OM的表观消化率不存在显著差异(P>0.05)。随着鸡肉粉替代比例的提高，各替代法组饲粮CF的表观消化率显著增加(P<0.05)。30%组与0组间GE的表观消化率没有显著差异(P>0.05)。各替代法组间饲粮EE的表观消化率差异不显著(P>0.05)。
2.2 直接法与替代法测定的比格犬粪便质量
由表3可知，100%组的粪便含水量显著高于其余各组(P<0.05)，30%组与45%组间差异不显著(P>0.05)。对于粪便评分来说，100%组最高，45%组显著高于30%组(P<0.05)，0组粪便评分最低。
表3 直接法与替代法测定的比格犬粪便质量
2.3 直接法与替代法测定的比格犬饲粮能值
由表4可知，5组间饲粮的GE、FE、UE、DE、ME与代谢能与消化能比值(ME∶DE)差异显著(P<0.05)。对于GE来说，100%组>45%组>30%组>15%组>0组。替代法中，15%组、30%组和45%组的FE显著高于100%组(P<0.05)。100%组的UE显著高于其余4组(P<0.05)，而30%组与45%组的UE不存在显著差异(P>0.05)。直接法饲粮DE与ME均显著高于替代法饲粮(P<0.05)。100%组的ME∶DE显著低于其余4组(P<0.05)，30%组与45%组间差异不显著(P>0.05)。各组间NE不存在显著差异(P>0.05)。2种方法的净能与代谢能比值(NE∶ME)差异不显著(P>0.05)。
表4 直接法与替代法测定的比格犬饲粮能值
2.4 直接法与替代法测定的鸡肉粉营养物质表观消化率及能值
由表5可知，对于单一蛋白质原料鸡肉粉的表观消化率来说，100%组的OM表观消化率显著高于各替代法组(P<0.05)。100%组和45%组CP与CF的表观消化率显著高于15%组和30%组(P<0.05)。100%组与30%组GE的表观消化率不存在显著差异(P>0.05)，但显著高于15%组与45%组(P<0.05)。对于DM表观消化率来说，替代法中30%组与45%组差异不显著(P>0.05)。100%组的DE显著高于30%组(P<0.05)，各替代法中组间不存在显著差异(P>0.05)。对于ME∶DE来说，100%组与30%组间差异不显著(P>0.05)。30%组与45%组间NE差异不显著(P>0.05)，但显著低于100%组(P<0.05)。30%组的NE∶ME显著高于100%组与45%组(P<0.05)。
表5 直接法与替代法测定的比格犬鸡肉粉营养物质表观消化率及能值
续表5项目Items鸡肉粉替代比例 Chicken meal substitution proportion/%100153045SEMP值P-value代谢能 ME17.7414.6913.6517.020.670.089净能 NE15.30a14.24ab13.26b13.60b0.280.034能量转化率 Energy conversion rate/%代谢能与消化能比值 ME∶DE85.81bc97.25a82.27c92.17ab1.590.001净能与代谢能比值 NE∶ME86.24b96.72a97.08a80.10b1.970.001
3.1 直接法与替代法测定的比格犬饲粮营养物质表观消化率
饲粮营养物质的表观消化率是反映犬对营养物质吸收利用情况的关键参考指标。饲粮组成、营养物质含量以及动物品种的差异都会对其结果产生影响。国家标准GB/T 31216—2014[17]中规定了成年犬饲粮中蛋白质含量需大于18%，本研究的5种试验饲粮均满足此要求。本试验得出直接法采用的100%组DM、OM、EE、CP、GE以及CF的表观消化率显著高于各替代法组，推测原因是鸡肉粉的适口性好，试验过程中不会因为比格犬DM采食量的差异而对结果产生影响。本研究中，随着替代法试验饲粮鸡肉粉替代比例的升高，CF含量升高，DM的表观消化率随之升高，这与周俊[18]在成年期藏獒中得出的CF含量与DM消化率呈负相关相悖。但Dainton等[19]研究发现，当成年雌性比格犬饲粮中粗纤维水平达到17.70%时，并不会影响其营养物质消化率以及粪便质量。本研究中，饲粮CF含量最高为11.97%，说明在一定范围内，比格犬可以很好地消化吸收饲粮中粗纤维。马利等[20]将32.5%的宠物级鸡肉粉添加到大口黑鲈鱼饲料中，并不影响其生长性能及健康指标，与本研究得到的30%替代比例接近，说明该替代比例不会对动物机体健康产生负面影响。范文文等[21]用20%的替代比例测定了水貂对5种非常规蛋白质饲料养分的消化利用情况，其中饲料原料血浆蛋白粉CP含量为68.41%，试验饲粮中CP含量为48.52%，得到血浆蛋白粉的CP表观消化率为88.82%，与本试验中直接法饲粮CP的表观消化率89.34%相近，进一步说明直接法能准确直观地评价蛋白质原料的营养物质消化情况。
3.2 直接法与替代法对比格犬粪便质量的影响
通过观察粪便形态评价犬的健康状况是临床上常用的方法，粪便太稀或太干都表示犬的健康状况出现异常。本研究中，采用5分制作为参考标准[14]，犬粪便最佳状态为2.5～3.0。本研究中，0组的粪便评分最佳，且与30%组最为接近。虽然45%组的粪便含水量与30%组不存在显著差异，但其粪便评分显著高于30%组，说明当待测原料替代比例过高时，可能会对犬的健康产生潜在影响。直接法组的粪便评分最高，达到了4.63，可能的原因是鸡肉粉的CP含量达到76.70%，机体出现了营养性腹泻的现象。
3.3 直接法与替代法的比格犬饲粮能值
由于试验过程中定量饲喂试验饲粮，所以犬摄入的GE随饲粮能值的增加而增多。一般来说，FE是动物能量代谢过程中损失最大的部分，本研究中，30%组的FE最高，其次是15%组、45%组与0组，100%组的FE最低。饲粮蛋白质含量越高，动物尿液中的含氮物质相应增多，UE也随之升高[22]，本研究中，100%组的UE显著高于其余4组，印证了这一观点。虽然100%组饲粮的DE与ME显著高于替代法各组饲粮，但对于ME∶DE来说，100%组最低，15%组最高。因此，可以推测造成GE表观消化率差异主要是因为UE不同。这与魏明[5]用直接法与套算法测定青贮玉米的能值得到的结论相反，原因可能是鸡肉粉CP含量过高，已达76.70%，并且在试验过程中100%组与45%组比格犬存在不同程度的营养性腹泻，导致样品采集过程中存在误差。替代法各组饲粮NE、NE∶ME并不存在显著差异，但当鸡肉粉替代比例达到45%时两者均出现了下降。饲粮能量增加能提高能量转化率，但当替代比例过高时，高能量的饲粮会对动物消化吸收的能力产生负面影响，所以45%组的饲粮NE出现了下降。
3.4 直接法与替代法测定鸡肉粉的表观消化率与能值
本研究中，替代法饲粮中30%组与45%组鸡肉粉DM、OM和EE的表观消化率不存在显著差异，45%组的CP表观消化率显著高于30%组。100%组与替代法中45%组鸡肉粉的EE、CF、CP和DM的表观消化率差异不显著。30%组的GE表观消化率显著高于45%组，但与100%组间不存在显著差异。本研究采用不同比例的鸡肉粉替代基础饲粮，来探究替代法在比格犬饲料原料有效能值测定上的可行性。直接法与替代法是体内消化试验中测定单一饲料原料的经典方法，其中替代法最为关注的问题是被测原料的替代比例，不同的替代比例会对结果造成不同的影响。对于犬来说，鸡肉粉的适口性好，可以直接饲喂，但受限于其营养物质组成不均衡。当前，在单胃动物(如猪[23]、鸡[24])上多采用替代法测定饲料原料能值，在伴侣动物(如犬和猫)上依照直接法与替代法研究其饲料能值的报道相对较少，对鸡肉粉的替代比例也没有明确的推荐范围。郑建婷[25]对成年贵宾犬(体重22 kg)鱼粉的营养物质消化率研究表明，25%的替代比例下，鱼粉的DE为15.09 MJ/kg，略低于本试验中30%组的DE(16.62 MJ/kg)，可能的原因是本研究中鸡肉粉的GE(22.86 MJ/kg)高于鱼粉的GE(17.24 MJ/kg)，并且本研究中30%组鸡肉粉DM表观消化率为74.52%，大于该鱼粉消化率(68.64%)，从而导致两者DE存在差异。魏明[5]用直接法和10%、30%、60%替代比例测定玉米的有效能值，发现替代比例过大或过小都会对有效能值的结果产生干扰，30%的替代比例有效能值变异最小。Noblet等[26]研究表明，高蛋白质饲粮的热增耗显著高于添加氨基酸的低蛋白质饲粮，证明饲粮蛋白质水平是产热量高低的主要因素[27]。本研究中，45%组与30%组间鸡肉粉的ME不存在显著差异，但45%组NE∶ME显著低于30%组，原因是NE∶ME表示ME转化为NE的效率，主要受热增耗的影响。45%组的蛋白质含量高于30%组，相对应的热增耗增多，转化效率降低，真正被动物有效利用的能量减少。因此，从以上结果可知，替代法在测定比格犬鸡肉粉有效能值时，适宜的替代比例为30%。
3.5 犬蛋白质饲料原料评价的推广应用
目前，食肉目动物营养与饲料的研究并不丰富，尤其饲料原料和相关评价方法的基础研究有待补充。仅有作为农场动物的水貂[28]、狐狸[29]等毛皮动物的饲料原料研究相对深入，而同为食肉目的伴侣动物(犬和猫)则较为匮乏，仅De Godoy团队[30]及少数欧美国家的科研机构在从事相关基础研究工作。
本试验丰富了我国犬蛋白质饲料原料研究的相关基础数据。在本试验条件下，以30%替代比例评价犬蛋白质饲料原料可以满足饲料原料评价的需求，并且可以确保试验动物的健康与福利。目前，国内更为侧重宠物全价配合饲料的评价，而忽略了饲料原料的评价，前者无法清晰反映出如何优化产品配方和合理利用原料，后者更能明确单一原料的营养学特性。
直接法测定的比格犬鸡肉粉营养物质消化率均高于替代法饲粮，但会导致犬营养性腹泻，从而对犬健康产生影响。替代法中45%组饲粮蛋白质含量高，损失的热量多，不利于犬对鸡肉粉的合理利用。在成年比格犬中，直接法与替代法在测定鸡肉粉的有效能值时，不同方法与替代比例都会对结果产生显著影响。综合考虑饲粮对犬健康的潜在影响以及能量转化效率等因素，建议使用替代法测定比格犬鸡肉粉的有效能值，且推荐适宜的替代比例为30%。
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