常艳婷,张闻博,夏梦思,范可可,胡晓萌,王淑华,张 雪,白一苇,张 娜,胡 陶,江泽慧
(国际竹藤中心,园林花卉与景观研究所,国家林业和草原局/北京市共建竹藤科学与技术重点实验室,北京 100102)
牡丹(PaeoniaSect.Moutan)属于芍药科芍药属牡丹组,其9个原生种都原产于我国。作为一种常见的园林植物,牡丹具有花大色艳、雍容华贵的特点,因此备受民众喜爱,被称作“花中之王”。牡丹的花期集中在4—5月,有效观赏时间受限。因此,探究牡丹开花时间的调控机理,并用于调控牡丹错峰开花,有利于增加牡丹的观赏价值。
SEPALLATA1(SEP1)是MADS-box家族的基因,在植物中普遍存在,并且在植物形态建成、花分生组织鉴定、花器官特化和果实成熟等方面的功能较为保守。桃中SEP基因参与调控果实的成熟与软化过程[1]。黄瓜中SEP基因与SHP基因互作,共同调控花器官的形成[2]。番茄中的SEP基因SlCMB1表达受到抑制会造成花序形态改变和花瓣的扩大[3]。水稻中SEP基因OsMADS5和OsMADS34则调控花序的分枝状态[4]。在植物ABCE模型中属于E类基因,调控花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊的发育。拟南芥中的4个SEP基因(SEP1、SEP2、SEP3、SEP4)在花器官发育过程中是花瓣、雄蕊和心皮发育所必需的,并且需要与ABC类基因共同行使功能[5-6],sep1sep2sep3sep4四突变体中,4种花器官全都突变为叶状的结构,而在sep1sep2sep3三突变体中则突变为萼片状的结构,但是AtSEP1、AtSEP2、AtSEP4在花发育的早期表达,如萼片原基和分生组织等,而AtSEP3则在后期表达,因此,SEPs基因被认为具有冗余但不完全相同的功能[5]。SEP还参与调控植物花形态建成,如心皮和胚珠的特化,主要是通过与其他转录因子蛋白互作来调控心皮和胚珠的特化。在十字花科的菘蓝(Isatisindigotica)中IiSEP4通过与IiSVP、IiSHP2和IiFUL之间发生蛋白互作来分别调控开花时间、柱头的鉴定和果实的发育[7]。梅花(Prunusmume)中的PmSEP4可以与PmSEP1和PmSEP2之间两两互作,但只参与萼片的形成,而PmSEP2和PmSEP3则参与梅花雄蕊和雌蕊的形成[8]。
SEP1还可以通过与ABC类基因形成蛋白复合体从而调控叶片转化为花器官的过程,缩短植物的营养生长时期,影响植物的开花时间。小麦中的SEP-like基因TaMADS1过量表达会导致拟南芥提早开花和花器官发育改变,如萼片变成叶片、花瓣和柱头的数目减少等[9]。甜樱桃中的PavSEP可以与PavSVP互作,共同促进成花转变[10]。牡丹中曾被报道1个在赵粉中克隆的SEP1基因PsMADS5,其在花瓣中的表达量远高于其他花器官,表明该基因可能参与花瓣的发育调控,但发挥功能的机制尚不清楚[11]。
牡丹中包括调控开花时间的SVP、SOC1、FUL和调控花器官发育的AGL6、AP1、SEP1、MADS4、MADS5等在内的MADS-box家族基因已见报道。其中,FUL1基因是在洛阳红中克隆得到,是调节开花的重要转录因子[12]。鲁菏红中PsSVP基因的表达量随着花芽休眠解除而上升,并且在拟南芥中超表达该基因可以造成开花时间的推迟和根长、株高的发育延缓[13]。紫斑牡丹(Paeoniarockii)中的PrSOC1基因在花芽中表达量最高,为牡丹开花时间调控提供了新的基因资源[14]。洛阳红中的PsAGL6在蔷薇型牡丹花瓣中表达量最高,表明其参与牡丹花器官的形成[15]。但牡丹中是否有参与调控开花时间的SEP1基因,还有待于进一步的挖掘。
本研究以二次开花牡丹品种海黄(High noon)花芽发育过程的cDNA文库为材料,获得PlSEP1基因的全长编码序列,利用生物信息学分析其理化特性和进化关系,通过实时荧光定量PCR分析PlSEP1基因在牡丹花芽发育不同时期的表达模式,探究PlSEP1与开花时间调控之间的关系,通过在拟南芥中异源过量表达来探索PlSEP1对植物生长发育的影响,进而为牡丹开花时间的调控提供理论依据。
1.1 试验材料
试验所用海黄牡丹品种来自山东省菏泽冠宇牡丹产业有限公司种植基地。海黄花芽在9月开始进入第1次花芽发育阶段,分别于2017年9月采集第1次开花的花芽营养期(Vegetative stage,VS),10,11月采集同一批次的花芽分化期(Differentiation stage,DS)及完成期(Differentiation completed stage,DCS)[16],采集的花芽置于液氮中速冻,之后用装有干冰的泡沫盒中运回实验室,置于-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取与定量PCR 利用RNA提取试剂盒(华越洋,中国)提取海黄花芽发育3个时期的总RNA。3个时期的RNA等量混合后测全长转录组,单独3个重复测二代转录组。利用反转录试剂盒(全式金,中国,AT311-02)合成cDNA。设计PlSEP1基因特异引物(表1),以TUBULIN基因为内参,利用TBGreenⅡ(TaKaRa,RR820A)定量试剂在qTOWER仪器(耶拿,德国)进行实时荧光定量PCR,每个样品设置3个技术重复,每组设置3次生物学重复。反应体系为20 μL(TBGreenⅡ mix 10 μL、上下游引物(20 mmol/L)1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL)。下机结果利用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
1.2.2PlSEP1基因CDS序列的获得与表达载体构建 利用拟南芥中的AtSEP1基因序列在园林花卉与景观研究所前期获得的海黄花芽全长转录组数据库中进行比对,获得相似性最高的同源基因,命名为PlSEP1,根据该基因的序列信息设计上、下游特异引物(表1),以海黄花芽的总cDNA为模板进行PCR扩增PlSEP1基因;PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳后胶回收,将获得的基因片段利用双酶切法连接到PHG载体中,通过转化大肠杆菌,挑选阳性克隆进行菌落PCR后,经测序验证正确,即为PlSEP1表达载体。
表1 引物信息列表Tab.1 Primer information list
1.2.3PlSEP1基因的多序列比对与建树 利用MAFFT软件[17]对PlSEP1和其他物种SEP1基因的氨基酸序列(NCBI网站下载)进行多序列比对,参数设置为默认参数。
利用MEGA 7软件[18]进行系统进化树的构建。经过ClustalW多序列比对后,利用Neighbour-Joining法(NJ法)计算遗传距离,参数设置:1 000步长重复,泊松模型。
1.2.4PlSEP1基因的生物信息学预测 利用NCBI CD-Search网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi?)预测PlSEP1基因编码氨基酸序列的保守结构域。利用ExPASy网站[19](https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)分析PlSEP1蛋白质的分子量和等电点、疏水性等理化性质。利用SiglalP-5.0软件[20](http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测PlSEP1中的信号肽。
1.2.5PlSEP1基因的亚细胞定位 将构建好的PlSEP1表达载体通过热激法转入农杆菌菌株GV3101,经过液体培养至OD600为0.6,集菌并悬菌,利用注射器侵染烟草叶片下表皮,光照培养3～7 d,剪取约0.5 cm×0.5 cm面积的叶片在荧光显微镜下488 nm激发光下观察发光情况,DAPI染色观察细胞核所在位置。
1.2.6PlSEP1基因的转基因验证 将构建好的PlSEP1表达载体转化农杆菌菌种GV3101,利用浸花法侵染拟南芥野生型(Col-0)花序,经过潮霉素筛选及扩繁获得稳定遗传的拟南芥植株。
2.1 PlSEP1基因CDS的获得与序列分析
以牡丹花芽的cDNA为模板,利用全长转录组设计引物,通过PCR得到长度为735 bp的片段,共编码244个氨基酸,测序后经Blast分析,表明该基因为植物SEP1的同源基因,命名为PlSEP1。NCBI CD-Search网站预测SEP1蛋白包含2个结构域,分别为MADS-DEF2-like结构域和K-box结构域(图1),表明PlSEP1属于MADS-box基因家族。
利用MAFFT软件对PlSEP1蛋白氨基酸序列与其他物种中的SEP1氨基酸序列进行比对,结果表明,PlSEP1蛋白与其他物种的SEP1的蛋白具有较高的相似性,具有MADS-box基因家族所特有的MADS-DEF2-like结构域和K-box结构域。
为探究PlSEP1与其他物种中SEP1的亲缘关系,利用MEGA 7软件对PlSEP1编码的氨基酸序列与其他物种中的SEP1的氨基酸序列构建系统进化树,发现PlSEP1与拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)、中华猕猴桃(Actinidiachinesis)亲缘关系较近,与香睡莲(Nymphaeaodorata)、中国莲(Nelumbonucifera)、郁金香(Tulipagesneriana)、同色兜兰(Paphiopedilumconcolor)和鸽石斛(Dendrobiumcrumenatum)亲缘关系较远,与前人报道的赵粉中的PsMADS5也较远(图2)。
图2 PlSEP1与其他物种SEP1的进化Fig.2 Phylogenetic tree of PlSEP1 and SEP1 proteins from other species
2.2 PlSEP1蛋白的理化性质预测
利用ExPASy软件预测得知,PlSEP1的相对分子质量为27 858.66,理论等电点(pI)为5.87,蛋白质分子式为C1215H1957N355O375S10,原子总数为3 912。该蛋白的不稳定系数为56.47,属于稳定蛋白。脂肪酸指数为75.36,总疏水性数值为-0.698,预测该蛋白为亲水性蛋白。利用SiglalP-5.0预测蛋白的信号肽,结果发现,PlSEP1蛋白中CS平均加权值为0.001 9,远小于0.5,故推测PlSEP1不含信号肽。
2.3 PlSEP1的亚细胞定位
为探究PlSEP1在细胞中的表达位置,本研究利用烟草叶片瞬时转化体系观察PlSEP1的亚细胞定位,结果发现,PlSEP1蛋白主要在细胞核中表达,与其转录因子特性一致(图3)。
图3 PlSEP1的亚细胞定位Fig.3 Subcellular localization of PlSEP1
2.4 PlSEP1的表达特性分析
利用实时荧光定量PCR反应检测PlSEP1基因在海黄不同组织材料中的表达量,结果显示(图4),PlSEP1基因在花芽中表达量最高,其次依次为花瓣、雄蕊、雌蕊和茎,而在叶中表达量最低,表明PlSEP1基因可能在花芽和花发育中发挥功能。
不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。图5—6同。Different lowercase letters above bars means significant difference(P<0.05).The same as Fig.5—6.图4 PlSEP1在不同组织中的表达量分析Fig.4 Relative expression level of PlSEP1 in different tissue
为进一步探究PlSEP1基因在花芽发育过程中的作用,本研究利用花芽发育的营养期、发育期和完成期的cDNA进行实时荧光定量PCR分析其表达量。结果显示,PlSEP1基因在花芽分化期表达量最高,而在营养期表达量最低(图5),表明PlSEP1在花芽的成花转变过程中发挥作用。
图5 PlSEP1在花芽发育过程中的表达量分析Fig.5 Relative expression level of PlSEP1 in floral bud development
2.5 PlSEP1过表达拟南芥的开花特性
为研究PlSEP1基因的功能,本研究在拟南芥中过量表达PlSEP1基因,获得稳定遗传的转基因植株OE1、OE2、OE3这3个株系(图6-A、B)。相比野生型,过表达PlSEP1的转基因拟南芥开花时间平均为27 d,而对照组开花时间平均为39 d(图6-C、D),转基因组显著早于对照组。同时观察开花时莲座叶数量,发现野生型植株开花时平均具有14片莲座叶,而过表达PlSEP1的拟南芥植株则在开花时的莲座叶数量均低于10片,显著低于对照组,这些结果表明PlSEP1可能参与调控开花时间。
图6 过表达PlSEP1拟南芥的早花表型Fig.6 Early flowering phynotype of OE-PlSEP1 in Arabidopsis
本研究利用前期获得的全长转录组中的序列信息在二次开花牡丹品种海黄中获得1个PlSEP1基因,经过序列分析发现,该基因具有MADS-box家族保守的结构域。进化分析发现,海黄中的PlSEP1蛋白与拟南芥、大豆和中华猕猴桃等物种中的SEP1蛋白亲缘关系较近,而赵粉中的SEP基因编码的PsMADS5蛋白则与鸽石斛更近,表明海黄与赵粉的亲缘关系较远,这可能与其亲本之间的亲缘关系相关,赵粉属于中原牡丹品种群,而海黄的亲本则是滇牡丹(Paeonialutea)。
荧光定量分析显示,本研究中的PlSEP1基因在海黄花芽分化期表达量最高,而在营养生长期和花芽分化完成期表达量较低,表明PlSEP1基因的功能主要是促进花芽的成花转变,而洛阳红中的FUL1基因表达量因花期早晚与开花时期不同而差异显著,表明其在开花时间调控中具有重要作用,而前人在牡丹品种赵粉中克隆得到的SEP基因PsMADS5则主要在花瓣中表达,可能参与花瓣的形态建成,表明SEP基因在牡丹中的作用不同。在拟南芥中过表达PlSEP1基因时则表现出开花提前的表型,表明PlSEP1基因具有促进开花的功能,这与小麦中的SEP基因TaMADS1[9]和崧蓝中的LiSEP1基因[21]表现一致,表明SEP基因在调控植物开花时间方面具有一定的保守性。而在雷竹中发现的SEP-like基因PvMADS5则具有抑制拟南芥植株开花的功能[22],与本研究中的基因功能相反,表明SEP1基因的功能分化具有多样性。本研究中的PlSEP1基因是通过何种机制促进花芽分化的,是否有其他因子的相互作用,还有待进一步的研究。
本研究中获得的PlSEP1是在牡丹品种海黄的花芽中克隆得到的,而海黄是牡丹中的一个特殊品种,具有连续形成花芽、连续成花的特性[23-24]。同时,PlSEP1基因具有促进拟南芥提早开花的特点,并且在花芽分化及形成过程中表达量显著变化,结合二者之间的关系,推断PlSEP1基因可能是通过影响海黄中花芽的形成,从而促使其连续成花,当然这一推论还需要进一步的证据来证明。本研究在二次开花牡丹品种海黄中获得的PlSEP1基因具有促进开花的生理功能,但在其他方面的功能还有待于进一步研究。
本研究在牡丹二次开花品种海黄中获得1个SEP类基因PlSEP1,其开放阅读框为735 bp,编码244个氨基酸,具有MADS-box基因家族成员保守的MADS-DEF2-like和K-box结构域,亲缘关系上PlSEP1与拟南芥、大豆和中华猕猴桃等物种中的SEP1较近。PlSEP1在花芽的成花转变过程中表达量升高,亚细胞定位在细胞核中,并且在拟南芥中超表达能够促进开花,因此,推测PlSEP1是促进牡丹开花的一个重要转录因子。
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