刘燕银，陈玉甜，陈立强
（1.广州市南沙区东涌医院，广东 广州 511453；
2.肇庆医学高等专科学校，广东 肇庆 526060）
动脉粥样硬化是一种由于炎症反应引起胆固醇在单核细胞内聚积而形成泡沫细胞，泡沫细胞粘附于动脉内壁而形成动脉斑块及血管硬化的疾病，现在对胆固醇的在单核巨噬细胞内积累还待深入研究[1]。泡沫细胞内胆固醇流出需要特定的转运蛋白参与有研究显示ABC转运体在胆固醇流出过程中发挥着重要作用，但是具体机制仍不清楚；
近年研究亦发现microRNA在不同的疾病的发病过程中发挥重要作用，包括冠心病。microRNAs是21-23 nt组成的非编码RNAs，其与mRNA3’-未翻译结构域序列互补结合并导致该mRNA的翻译受抑制[2]。本研究通过观察ABCA1和microRNA-33基因在THP-1细胞、巨噬细胞与泡沫细胞中的表达变化，旨在初步探讨ABCA1和microRNA-33基因在胆固醇流出的作用，为进一步探讨动脉粥样硬化形成机制奠定基础。
1.1 主要试剂 THP-1细胞购于中科院上海细胞库，逆转录PCR试剂盒购于大连宝生物公司，PCR引物由上海生物工程公司合成，miRNA qRT-PCR检测试剂盒购于GeneCopoeia公司、Trizol购于life公司、qRT-PCR自动分析仪9700购于ABI公司等。
1.2 细胞培养和分组 THP-1细胞用含100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37oC，5%CO2培养箱中培养，取对数生长期的THP-1悬浮细胞接种于六孔细胞培养板，每孔加160nmol/L佛波酯诱导细胞贴壁，培养24 h，使其分化成为巨噬细胞；
培养24 h后更换含0.1%牛血清白蛋白的RPMI-1640培养基，同时加入50 μg/mL的乙酰化低密度脂蛋白，培养24 h，诱导其成为泡沫细胞。
1.3 方法
1.3.1 抽提THP-1细胞总RNA 取 TRIzol 处理好的匀浆THP-1细胞，室温静置；
加入0.2 mL氯仿，剧烈震动15 s，室温静置2 min；
12000×g 4oC离心15 min，移上层水相至新EP管，加0.5 mL异丙醇，混匀后室温静置10 min；
4oC 12000×g离心10 min 弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀，4oC 7500×g离心5 min；
弃上清空气中干燥；
20 μL无RNA酶水溶解总RNA，60oC孵育10 min。紫外分光光度仪检测提取的总RNA 浓度，-80oC保存。
1.3.2 测定ABCA1基因RNA含量 根据ABCA1基因在文献服务检索系统（Pubmed）中查到的GenBank序列，按照引物设计原则设计引物，引物交由上海生物工程公司合成，ABCA1基因上游引物5’-CAGGAGGTGATGTTTCTGACCA-3’；
下游引物5’-TTGGCTGTTCTCCATGAAGGTC-3’，产物长度449 bp；
β-actin上游引物5’-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3’下游引物5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’，产物长度538 bp。以提取的RNA为模板，反应条件为50oC 30 min，94oC 2 min，94oC 30 s，58oC 30 s，68oC 40 s，35个循环。RT-PCR反应完成后取3 μL RT-PCR产物，在1%琼脂糖凝胶中于80 V恒压电泳30 min，紫外透射仪观察并拍照。图片经图像分析软件Band Scan进行光密度值扫描分析，计算各泳道ABCA1与内参照β-actin光密度之比作为ABCA1相对含量值。
1.3.3 荧光定量PCR 利用miRNA qRT-PCR检测试剂盒逆转录1 μg总RNA，按照GeneCopoeia公司说明书对microRNA特异性引物和接头引物进行PCR反应，用U6作为内源性参照基因，检测microRNA-33的表达水平。
1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS 15.0统计软件进行分析，计量资料采用Mean±SD表示，正态分布资料用单因素方差分析比较多组间差异，用t检验比较两组间的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 THP-1细胞、巨噬细胞和泡沫细胞中ABCA1基因mRNA表达 与对照组的THP-1细胞比较，巨噬细胞组ABCA1基因表达水平无明显变化（P＞0.05），而泡沫细胞组ABCA1基因表达水平明显提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。THP-1细胞、巨噬细胞和泡沫细胞中ABCA1基因 mRNA表达分别为（0.329±0.025）、（0.336±0.023）和（0.537±0.046），见图1。
2.2 microRNA-33检测结果 如图2所示，与对照组的THP-1细胞比较，巨噬细胞组microRNA-33基因表达水平无明显变化（P＞0.05），而泡沫细胞组microRNA-33基因表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
ABCA1转运体通过利用ATP帮助底物进行跨膜转运，而在避免单核细胞泡沫化中ABCA1转运体发挥着重要作用。胆固醇在单核细胞内聚集使其泡沫化，泡沫细胞沉积于动脉内皮造成血管硬化、炎症效应和发展为动脉粥样硬化，研究表明microRNA-33与其作用基因（SREBF2和SREBF1）共同表达，协同表达转录因子参与胆固醇和脂肪酸的合成与吸收[3]。因此，胆固醇流出并分解代谢是预防动脉粥样硬化的一个很重要的因素，胆固醇转运需多种调节因子相互配合，包括ABC转运体家族、清道夫受体家族、胆固醇调节蛋白和肝X受体等[4]。研究显示对ABCA1转运蛋白进行基因敲除，可造成泡沫细胞胆固醇流出功能障碍而引起胆固醇积累和炎症的发生，microRNA-33通过抑制SREBF2和SREBF1基因以及下游的细胞信号通路的表达，从而对参与胆固醇流出的基因进行调控，包括ABCA1、ABCG1、NPC1和FAO（HADHB、CROT、CPT1A、PRKAA1）等基因[5-6]。
本研究通过利用人急性单核细胞白血病细胞系-1（THP-1）源性泡沫细胞为研究对象，观察细胞内ABCA1和microRNA-33基因表达情况。课题组利用泡沫细胞模型，采用半定量RT-PCR检测THP-1细胞、巨噬细胞与泡沫细胞ABCA1和microRNA-33基因表达水平变化，结果显示与对照组的THP-1细胞比较，巨噬细胞组ABCA1基因表达水平无明显变化（P＞0.05），而泡沫细胞组ABCA1和microRNA-33基因表达水平有明显差异，差异有统计学意义（P＜0.05）；
因此胆固醇逆向转运需ABCA1基因参与，ABCA1介导泡沫细胞胆固醇流出，而microRNA-33基因与ABCA1基因表达呈负相关，本研究结果为动脉粥样硬化的形成提供了新的理论依据。
