郭沫然，俞 伟，，贾若冰，刘思萌，刘梦萱，程永强，甘 晶
（1.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264000；
2.中国农业大学食品营养与工程学院，北京 100083）
单环刺螠，俗称“海肠”，有“裸体海参”的称号，主要分布于胶东地区，烟台、青岛等地是海肠的主要产区，生长于浅海滩中，肉质鲜美、营养丰富，得到了很多人青睐[1]。单环刺螠体内具有许多特定功能的多肽和多糖、酶等活性物质，如纤溶酶、速激肽、抗菌肽、糖胺聚糖、抗硫化物等，研究表明这些物质对抗菌、抗肿瘤、抗氧化具有积极作用[2]。刘春娥等人[3]发现单环刺螠酶解产物具有抗氧化的功效；
初金鑫[4]从单环刺螠中分离出纤溶酶，其具有溶血栓的活性；
陈翔[5]通过大鼠试验证实纤溶酶可以抑制肌酸磷酸激酶和谷草转氨酶的升高，使血浆凝血酶的时间得以延长；
温春光等人[6]从单环刺螠体内分离出速激肽，这些肽类物质具有消炎和抗癌的功效，单环刺螠因其具有的功能活性肽而深受人们的喜爱，更被开发成高档调味品。
调味品是一种可以调节食物风味（气味和滋味）并且可以起到增鲜、解腻、去腥等作用的产品[7]。目前，市场上的调味品主要分为复合调味品（虾油、鸡汁、蚝油等） 和单一呈味调味品（食盐、味精、白砂糖等）。如今，随着生活水平的提高，人们不仅注重调味品的风味，更加注重其营养和健康，因此一些具有特定功能的调味品不断出现。
目前，制备功能活性肽主要是有以下4 种方法，分别为化学水解法、酶解法、化学合成法和微生物发酵法。
赵翊君[8]将鲈鱼鱼肉用木瓜蛋白进行水解，然后经超滤、凝胶层析分离纯化出抗氧化肽；
Jiang Xin等人[9]利用枯草芽孢杆菌来发酵玉米麸皮来制备多肽，并且通过小鼠试验发现这种活性肽具有抗氧化功效。随着酶解技术的广泛应用，酶解水产品提取工艺已应用于生产实践中。
通过单因素试验及响应面法，以水解度为指标，确定最佳酶的种类、料液比、酶解时间、酶解温度、pH 值及超声时间，以期提高其水解度，获取更多功能多肽，为开发高档单环刺螠调味品提供理论依据及深加工提供参考。
1.1 试验材料
海肠，购自烟台莱山区水产市场。
胰蛋白酶，上海如吉生物技术有限公司提供；
木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，Solarbio 公司提供；
甲醛，烟台健硕化工有限公司提供。
1.2 仪器
电热鼓风干燥箱，南京第一医疗器械厂产品；
超声波清洗器，济宁科源仪器有限公司产品；
电炉，龙口市电炉制造厂产品；
数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；
超低温冰箱，杭州硕联电器有限公司产品；
超纯水系统，莱特莱德有限公司产品；
pH 计，上海精密科学仪器有限公司产品；
高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；
电子天平，梅特勒-托利多精密仪器有限公司产品。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
单环刺螠→去内脏、清洗→冷冻干燥→研磨粉碎→调pH 值→加酶→保温酶解→离心→上清液→单环刺螠酶解液。
1.3.2 操作要点
将新鲜的海肠去内脏、清洗后放入-80 ℃的冰箱中，将冷冻后的海肠放入冷冻干燥器中，24 h 后拿出冷冻干燥好的海肠，研磨粉碎后溶于适量蒸馏水，对其进行pH 值调节，加入适量蛋白酶，再放入恒温水浴中进行酶水解。水解完成后，于95 ℃下进行灭酶、冷却、离心，取上清液。
1.3.3 蛋白酶的选择
以水解度为指标，在所得最适的条件下用胰蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶分别对海肠体壁肌进行酶解，选择水解度最高的3 种蛋白酶。
不同蛋白酶的最适酶解参数见表1。
表1 不同蛋白酶的最适酶解参数
1.3.4 单环刺螠的酶解单因素试验
通过控制加酶量4%，超声时间50 min，料液比1∶50 不变，探究反应时间、pH 值、反应温度对酶解液水解度的影响。
（1） pH 值对酶解液水解度的影响。为了探究pH 值对酶解液水解度的影响，选取pH 值7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 这5 个梯度进行试验。
（2） 酶解时间对酶解液水解度的影响。为了探究酶解时间对酶解液水解度的影响，选取1，2，3，4，5 h 这5 个梯度进行试验。
（3） 酶解温度对酶解液水解度的影响。为了探究酶解温度对酶解液水解度的影响，选取45，50，55，60，65 ℃这5 个温度梯度进行试验。
1.3.5 响应曲面优化设计试验
以单因素试验结果为基础，采用Box-behnken试验设计方法，用pH 值、酶解温度、酶解时间进行三因素三水平响应面试验，以酶解液的水解度作为指标，探究酶解的最优条件。
响应面试验因素与水平设计见表2。
表2 响应面试验因素与水平设计
1.3.6 水解度的测定
用中性甲醛法[10]测定游离氨基酸，用凯氏定氮法[11]测定总氮含量。
水解度按式（1） 计算。
式中：DH——水解度；
C——NaOH 标准溶液的浓度，mol/L；
V——酶解液消耗的NaOH 标准溶液体积，mL；
V0——空白液消耗的NaOH 标准溶液体积，mL；
0.014——1 mL 浓度为1.000 mol/L 的NaOH 标准溶液相当于氮的质量，g；
N——底物样品的总氮含量，g。
3.1 蛋白酶的选择
水解度，即蛋白质经过酶解后游离氨基酸的量与总氮的比值，反映肽键的断裂程度，是一种可以反映蛋白质水解程度的重要指标。通常情况下，蛋白质的水解程度越大，其水解度就越高。
不同蛋白酶对酶解效果的影响见表3。
表3 不同蛋白酶对酶解效果的影响/ %
由表3 可知，胰蛋白酶的水解度最高，为28.1%，其次为风味蛋白酶和木瓜蛋白酶分别为22.1%，19.4%，水解度最低的是胃蛋白酶。胰蛋白酶[12]水解度最高是因为它属于肽链内切酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，是特异性最强的蛋白酶。海肠作为一种氨基酸丰富的海产品，精氨酸和赖氨酸的含量较高。因此，其水解度较高。综合来看，选用水解较高的胰蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶来进行后续的复合酶解。
3.2 单因素试验结果
3.2.1 pH 值对酶解液水解度的影响
pH 值对酶解效果的影响见图1。
图1 pH 值对酶解效果的影响
为了探究pH 值对酶解液水解度的影响，选取pH 值7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 这5 个梯度进行试验。由图1 可知，随着pH 值的升高，水解度呈先升高后降低的趋势，在pH 值为8.5 时，水解度最高为34.4%。主要是因为随着pH 值的升高，复合蛋白酶的活性增强，但当pH 值超过8.5 时，其会超过复合酶的最佳pH 值范围，因此水解度会下降[13]。
3.2.2 酶解时间对酶解液水解度的影响
为了探究酶解时间对酶解液水解度的影响，选取1，2，3，4，5 h 这5 个梯度进行试验。由图2 可知，随着酶解时间的延长，水解度逐渐增加，之后趋于平稳。主要是因为酶解时间越长，蛋白质被水解得越充分，在酶解时间到达3 h 后，水解度趋于平缓，主要是随着反应的进行，底物在不断减少，水解速率也会下降。
图2 酶解时间对酶解效果的影响
酶解时间对酶解效果的影响见图2。
3.2.3 酶解温度对酶解效果的影响
酶解温度对酶解效果的影响见图3。
图3 酶解温度对酶解效果的影响
为了探讨酶解温度对酶解液水解度的影响，选择了45，50，55，60，65 ℃这5 个温度梯度进行试验。由图3 可知，随着温度的升高，水解度先升高后降低。当温度为50℃时，最大水解度为30.2%。这主要是因为复合蛋白酶的活性随着温度的升高而增加，但当温度超过55 ℃时，会导致蛋白酶变性，因此水解程度会降低[14]。
3.3 响应曲面优化试验结果分析
根据单因素试验结果，根据上述试验因素和水平，以水解度作为响应值，采用Design Expert 8.0 软件进行三因素三水平的Box-behnken 试验设计。
响应面设计方案及结果见表4。
表4 响应面设计方案及结果
用Design Expert 12 对响应面结果进行二次多元回归拟合[15]，得到酶解pH 值（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C） 的二次多项回归方程：
DH=34.06+0.662 5A+0.475 0B+0.637 5C-0.375 0AB+0.000 0AC-0.225 0BC-1.88A2-1.96B2-1.88C2.
方差分析见表5。
表5 方差分析
由表5 可知，模型具有p＜0.000 1，不匹配不显著（p=0.234 3＞0.05），表明模型显著，所选二次模型是合适的。模型的R2=0.988 3，R2Adj=0.973 4 表明，该模型拟合度好，试验误差小，适合于分析和预测海肠的水解度。此外，因素A、B、C、A2、B2和C2对结果有显著影响（p＜0.01），而因素AB、AC 和BC对结果没有显著影响（p＞0.05）。根据因子分析，3 个反应条件对水解度的影响依次为pH 值＞酶解时间＞酶解温度。
响应面分析图和等高线图见图4。
图4 响应面分析图和等高线图
由图4 可知，AB、AC 和BC 的等高线图大致呈圆形，表明酶解温度、酶解时间和pH 值之间的相互作用不显著。AB 三维图是固定酶解时间，即3 h。基于此，可以得出结论，当酶解时间固定时，pH 值轴上的响应值比酶解温度轴上的响应值更陡，这表明pH 值对水解度的影响大于酶解温度。AC 立体图是将酶解温度固定为50 ℃。由此可以得出结论，当酶解温度恒定时，pH 值轴上的响应值比酶解时间轴上的响应值陡峭，这表明pH 值对水解程度的影响大于酶解时间。BC 三维图确定酶解pH 值为7。基于此，可以得出结论，当酶解pH 值恒定时，酶解时间轴上的响应值比酶解温度轴上的响应值更陡，这表明酶解时间对水解度的影响大于酶解温度。可以看出，该结论与方差分析的结论是一致的。此外，根据AB 的三维图，水解度随着pH 值和酶解温度的升高而增加，但在达到峰值时逐渐减弱。AC 的三维图与BC 的三维图大致相同，这可以通过相同的原因获得。
根据对响应面的结果进行二次多元回归拟合所得响应面拟合方程进行参数最优分析，最终预测得到最佳工艺条件为pH 值8.58，酶解时间3.16，酶解温度50.48。为了便于操作，酶解时间设为3 h，酶解温度设为50 ℃，pH 值设为8.5，在此条件下进行3 组平行试验，水解度的实际测得值为34.4%，与模型的预测值34.19%接近，相对误差为1.33%。
以海肠为原材料研究其酶解的最佳工艺，在单因素试验的基础上，采用响应面法建立了海肠酶解工艺的二次多项式数学模型，对酶解条件进行了优化。通过分析酶解pH 值、酶解温度、酶解时间三因素交互作用对酶解海肠水解度的影响，得到最佳酶解时间3.16 h，pH 值8.58，酶解温度50.48 ℃，此时的水解度DH 值34.19%。该研究可获取更多功能多肽，为开发高档单环刺螠调味品提供理论依据及深加工提供参考。
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