谢宜兵，黄洁，邓婷婷，马世杰，孙文武，吴滨
（中南民族大学 药学院，武汉 430074）
核苷作为一种基本的生物分子，是构成DNA和RNA的重要结构单元，在生命体内的细胞信号传导与新陈代谢过程中均起着关键作用［1］.通过模拟天然核苷的基本骨架获得的核苷类似物（nucleoside analogs）在治疗病毒感染和抗肿瘤方面取得了巨大的成功［2-3］.核苷类药物可以干扰病毒核酸的复制，从而抑制疱疹病毒的繁殖［4］.代表性的核苷类抗病毒药物有阿昔洛韦（Acyclovir，ACV）、更昔洛韦（Ganciclovir）和喷昔洛韦（Penciclovir）等（图1）.伐昔洛韦（Valaciclovir）和缬更昔洛韦（Valganciclovir）分别为阿昔洛韦与更昔洛韦的缬氨酸酯前药，氨基酸的引入较好地改善了原药物水溶性差、半衰期短、生物利用度不高的缺点［4-5］.
图1 核苷类抗病毒药物Fig.1 Nucleoside antiviral drugs
以现有核苷药物作为先导化合物来筛选新药是一条合理的途径［6-7］.同时，计算机辅助药物设计（CADD）已成为合理药物设计中不可或缺的一环，在新药研发中发挥着越来越重要的作用.细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）是潜在的细胞靶点，参与病毒基因组的转录和复制［8-10］.最近通过药理实验再次证实［11］，CDK2抑制剂具有抗单纯疱疹病毒（HSV）活性.因此，以CDK2为靶点的抗病毒药物已经成为目前研究的热点.
本文以抗病毒药阿昔洛韦为先导化合物，设计并合成了8个阿昔洛韦衍生物，并以此类化合物及其脱Cbz（苄氧羰基）保护基后的结构为配体，通过计算机辅助药物设计方法研究阿昔洛韦衍生物与CDK2靶蛋白分子对接情况，预测了阿昔洛韦衍生物的抗HSV活性.
1.1 仪器与试剂
N-1300D-WB旋转蒸发仪（上海爱朗仪器）；
HSGF254薄层层析硅胶板（烟台江友）；
ZF-1型三用紫外线分析仪（上海金鹏分析仪器）；
300～400目硅胶（烟台江友）.阿昔洛韦、N-Cbz-甘氨酸、N-Cbz-L-缬氨酸、N-Cbz-L-异亮氨酸、N-Cbz-L-蛋氨酸、N-Cbz-O-苄基-L-苏氨酸、N-Cbz-L-脯氨酸、N-Cbz-L-哌啶甲酸、N-Cbz-甘氨酰-L-脯氨酸、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷（DCM）均购买于伊诺凯.
1.2 目标化合物的合成
向干燥的25 mL反应瓶中依次加入阿昔洛韦（1.0 mmoL）、N-Cbz-氨 基 酸（1.2 equiv）、EDCI（1.5 equiv）、DMAP（0.1 equiv）和DMF（2.0 mL），将反应混合物置于室温下反应24 h.待反应完全后，向反应液中加入冷水使产物析出，抽滤，用水洗涤3次，取滤饼烘干，得到粗产物.将粗产物转移至圆底烧瓶中，加入适量DCM和适量硅胶，用循环水泵旋干DCM的同时保证粗产物和硅胶混合均匀，干法上样，柱层析分离得到目标化合物（图2）.
图2 阿昔洛韦衍生物的合成Fig.2 Synthesisof acyclovir derivatives
根据图2所示的合成路线，本文考察了7种不同天然和非天然氨基酸以及一种二肽底物与阿昔洛韦酰胺化的反应效果，合成了8种不同的氨基酸及二肽取代的阿昔洛韦衍生物.
1.3 分子对接
1.3.1 配体的准备
在Chem3D软件中画出配体的结构式，保存为“mol2.”格式文件，在Sybyl软件中，分别将配体分子采用Minimize程序进行结构优化，设Max Iterations值为10000，加上Tripos力场以及Gasteiger-Huckel电荷，完成这一系列操作后，再次保存为“mol2.”格式.建立配体文件数据库，将处理的配体文件加入到该数据库中.
1.3.2 受体来源及处理
从PDB数据库中下载CDK2（PDB ID：2A4L）的晶体结构，保存为“pdb.”格式，在Sybyl软件中，对该靶蛋白用Application中的Docking程序进行处理，删除所含的水分子后，依次进行加氢、加电荷、提取复合物晶体中的配体小分子的操作，将处理后的蛋白保存.
1.3.3 受体-配体对接
以阿昔洛韦和八个阿昔洛韦衍生物为配体，细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2（PDB ID：2A4L）为受体，在Sybyl软件中，运用Surflex-Docking程序进行分子对接，对接结果以打分函数（Total Score）给出.对接的二维结构采用Discovrey Studio进行分析.
以上计算步骤，各项参数没有特别说明，均以默认值进行.
分子对接的结果以打分函数（Total Score）表示.在Sybyl软件中，Total Score≥7.5时则具有参考价值［12-13］，这一数值用于评价配体与受体蛋白的结合强弱，可以很直观地反应化合物与受体结合的亲和力强弱，分值越高，亲和力越强，对接复合物越稳定，结合作用越好［14-15］.
2.1 目标化合物的合成
如表1所示，不同的氨基酸底物都能以良好的收率获得目标化合物.在标准的反应条件下，以5种直链氨基酸N-Cbz-甘氨酸2a，N-Cbz-L-蛋氨酸2b、NCbz-L-缬氨酸2c、N-Cbz-L-异亮氨酸2d和N-Cbz-O-苄基-L-苏氨酸2e为底物时，目标化合物3a～3e的收率在75%～82%之间.以脯氨酸与哌啶甲酸修饰的阿昔洛韦衍生物3f与3g的收率分别为85%和84%.当以N-Cbz-甘氨酰-L-脯氨酸为原料时，二肽取代的阿昔洛韦衍生物的收率也能达到69%.所合成的8个阿昔洛韦衍生物中仅化合物3c为已知化合物，其他7个化合物还未见文献报道.
表1 氨基酸与二肽底物的扩充Tab.1 Substratescope of aminoacidsand dipeptide
2.2 化合物的结构表征
2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl） methoxy） ethyl（ （benzyloxy） carbonyl） glycinate（3a）：1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.72（s，1H），7.82（s，1H），7.68（t，J=6.6 Hz，1H），7.37-7.29（m，5H），6.53（s，2H），5.35（s，2H），5.02（s，2H），4.15-4.11（m，2H），3.73（d，J=6.2 Hz，2H），3.68-3.64（m，2H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ171.3，157.9，157.6，154.9，152.4，138.7，137.7，129.2，128.7，128.5，117.1，72.3，66.8，66.1，63.9，42.3.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C18H21N6O6417.1523，Found 417.1516；
IR（KBr）v（cm-1）：3641，2955，1728，1631，1431，1214.
2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl） methoxy） ethyl （（benzyloxy） carbonyl） -Lmethioninate（3b） ：［α］25D-43.1（c0.50，CH3OH）；
1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.68（s，1H），7.81（s，1H），7.75（d，J=7.8 Hz，1H），7.38–7.29（m，5H），6.52（s，2H），5.34（s，2H），5.02（s，2H），4.25-4.08（m，3H），3.68-3.64（m，1H），2.48-2.40（m，1H），1.98（s，3H），1.87-1.76（m，2H），1.34（s，2H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ 173.2，157.8，157.1，154.8，152.3，138.5，137.6，129.1，128.6，128.5，117.1，72.1，66.8，65.9，63.8，52.8，34.5，30.5，30.1，29.6，14.4.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C21H27N6O6S 491.1713，Found 491.1704；
IR（KBr）v（cm-1）：3419，3323，1689，1626，1604，1530.
2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl） methoxy） ethyl （（benzyloxy） carbonyl） -L-valinate（3c） ：［α］25D-23.4（c0.46，CH3OH）；
1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.72（s，1H）7.81（s，1H），7.67（d，J=8.2 Hz，1H），7.38-7.33（m，5H），6.56（s，2H），5.34（s，2H），5.03（s，2H），4.25-4.20（m，1H），4.14-4.08（m，1H），3.89（t，J=7.1 Hz，1H），3.69-3.62（m，2H），1.99-1.92（m，1H），0.83（d，J=6.8 Hz，3H），0.81（d，J=6.8 Hz，3H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.6，157.6，157.1，154.7，152.2，138.3，137.5，129.0，128.5，128.4，117.0，72.0，66.7，65.8，63.3，59.8，29.6，18.7，18.0.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C21H27N6O6459.1992，Found 459.1983；
IR（KBr）v（cm-1）：3325，3193，1725，1698，1630，1608，1541.
2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy）ethy（l（benzyloxy） carbonyl） -L-isoleucinate（3d） ：［α］25D-7.3（c0.50，CH3OH）；
1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.63（s，1H），7.80（s，1H），7.68（d，J=8.1 Hz，1H），7.38-7.32（m，5H），6.51（s，2H），5.33（s，2H），5.01（s，2H），4.24-4.07（m，2H），3.93（dd，J=7.9 and 7.9 Hz，1H），3.68-3.61（m，2H），1.73-1.66（m，1H），1.38-1.28（m，1H），1.18-1.10（m，1H），0.78-0.74（m，6H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.6，157.6，157.0，154.7，152.1，138.3，137.5，129.0，128.5，128.4，117.0，72.0，66.8，65.8，63.3，58.7，36.1，24.8，15.2，11.0.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C22H29N6O6472.2070，Found 472.2142；
IR（KBr）v（cm-1）：1725，1630，1541，1388，1103，1045.
2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethylO-benzyl-N（-（benzyloxy） carbonyl）-L-threoninate（3e）：［α］25D+22.2（c0.14，CH3OH）；
1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.68（s，1H），7.78（s，1H），7.53（d，J=8.8 Hz，1H），7.36-7.21（m，10H），6.51（s，2H），5.31（s，2H），5.04（s，2H），4.46（d，J=11.9 Hz，1H），4.29（d，J=11.9 Hz，1H），4.19（dd，J=8.8 and 3.9 Hz，1H），4.17-4.02（m，2H），3.92-3.86（m，1H），3.69-3.63（m，2H），1.11（d，J=6.3 Hz，3H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ171.4，157.8，157.6，154.8，152.3，139.1，138.6，137.7，129.1，128.9，128.6，128.3，128.2，128.1，117.1，74.3，72.2，70.4，66.7，66.0，64.0，59.1，15.9.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C27H31N6O7551.2254，Found 551.2246；
IR（KBr）v（cm-1）：1716，1644，1530，1212，1092.
2-（2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethyl） 1-benzyl（ S） -pyrrolidine-1，2-dicarboxylate（3f）：［α］25D-41.1（c0.50，CH3OH）；
1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.67（s，1H），7.80（d，J=17.6 Hz，1H），7.40-7.20（m，5H），6.51（s，2H），5.35-5.28（m，2H），5.09-4.92（m，2H），4.28-4.00（m，3H），3.68-3.63（m，2H），3.40-3.33（m，2H），2.20-2.08（m，1H），1.84-1.68（m，3H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ173.4，173.1，157.8，154.9，154.8，154.4，152.3，138.6，138.5，137.6，137.5，129.2，129.0，128.6，128.5，128.2，127.9，117.1，72.2，72.1，66.8，66.7，66.4，66.4，63.6，59.1，58.6，47.0，46.4，30.4，29.4，23.9，23.0.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C21H25N6O6457.1836，Found 457.1828；
IR（KBr）v（cm-1）：1697，1631，1541，1419，1389，1181，1105.
2-（2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethyl） 1-benzyl（S） -piperidine-1，2-dicarboxylate（3g）：［α］25D-23.7（c0.51，CH3OH）；
1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.70（s，1H），7.79（d，J=13.1 Hz，1H），7.39-7.28（m，5H），6.51（s，2H），5.32（d，J=11.7 Hz，2H），5.10-5.03（m，2H），4.75-4.68（m，1H），4.22-4.14（m，2H），3.84（d，J=12.9 Hz，2H），2.92-2.69（m，1H），1.96（t，J=13.9 Hz，1H），1.57-1.48（m，3H），1.36-1.20（m，2H），1.04-0.92（m，1H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.2，172.1，157.9，156.7，156.2，154.8，152.4，138.6，137.6，137.5，129.3，129.2，128.7，128.6，128.2，128.1，128.0，117.1，72.2，67.0，66.8，66.7，63.9，54.5，54.3，41.7，41.6，26.4，24.2，24.1，19.9，19.8.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C22H27N6O6471.1992，Found 471.1985；
IR（KBr）v（cm-1）：1697，1630，1389，1257，1165，1104.
2-（（2-Amino-6-oxo-1，6-dihydro-9H-purin-9-yl）methoxy） ethyl（ （benzyloxy） carbonyl）glycyl-Lprolinate（3h）：［α］25D-22.8（c0.55，CH3OH）；
1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ10.69（s，1H），7.84-7.80（m，1H），7.40-7.26（m，5H），6.56（s，2H），5.38-5.31（m，2H），5.05-4.98（m，2H），4.26（dd，J=8.8 and 3.8 Hz，1H），4.20-4.02（m，2H），3.92-3.72（m，2H），3.70-3.60（m，2H），3.54-3.42（m，2H），3.16（d，J=5.2 Hz，1H），2.20-2.00（m，1H），2.00-1.75（m，2H），1.75-1.65（m，1H）.13C｛1H｝NMR（125 MHz，DMSO-d6）δ172.7，172.6，168.4，168.2，157.6，157.2，154.7，154.6，152.1，138.4，137.7，128.9，128.4，128.3，127.7，117.0，72.3，72.1，71.9，70.6，66.6，65.6，63.8，63.4，60.1，58.6，57.9，48.7，46.4，45.5，42.6，42.5，30.8，28.5，24.3，21.6.HRMS（ESI）m/z：［M+H］+Calcd for C23H28N7O7514.2050，Found 514.2044；
IR（KBr）v（cm-1）：3565，3502，3446，1651，1645，503，461，446，409.
2.3 数据分析及处理
阿昔洛韦及其酯化衍生物3a～3h与CDK2（PDB ID：2A4L）的对接打分结果如表2所示.其中，化合物3a、3b、3d的对接打分结果较好，且化合物3a、3b、3d的结构与阿昔洛韦均有很好的叠合效果.在Discovery Studio软件中，用Receptor下的Ligand Interactions程序对分子对接结果进行分析，通过Shoe 2DDiagram模块分别展示打分结果大于9的化合物3a、3b和3d对接结果的二维结构.阿昔洛韦与CDK2的对接结果显示，阿昔洛韦与氨基酸残基ASP145和LEU83形成氢键，与PHE80形成π-π键.相比阿昔洛韦，所合成的目标化合物3a（图3）、3b（图4）和3d（图5）与CDK2对接可与氨基酸残基形成更多的氢键.由于羟基位置被取代，配体3a、3b和3d不与氨基酸残基LEU83形成氢键作用，却仍然保留与ASP145的氢键，除此之外，3a、3b和3d均与氨基酸残基LYS89、ASP86形成氢键，与氨基酸残基PHE80形成π-π键.
图3 3a（红色结构）和阿昔洛韦（绿色结构）与CDK2的对接结果图Fig.3 Molecular docking mode between 3a（red structure）and ACV（green structure）with CDK2（PDB ID：2A4L）
图4 3b（橘色结构）和阿昔洛韦（绿色结构）与CDK2的对接结果图Fig.4 Molecular dockingmodebetween 3b（orangestructure）and ACV（green structure）with CDK2（PDBID：2A4L）
图5 3d（紫色结构）和阿昔洛韦（绿色结构）与CDK2的对接结果图Fig.5 Molecular docking mode between 3d（purple structure）and ACV（green structure）with CDK2（PDBID：2A4L）
表2 ACV和3a～3h与CDK2（PDBID：2A4L）的对接打分结果Tab.2 Dockingand scoringresultsof ACV and 3a～3h with CDK2（PDBID：2A4L）
进一步以脱Cbz保护基的阿昔洛韦衍生物为配体与CDK2进行对接，对接的打分结果如表3所示.化合物3b′～3g′的对接打分分值较高，与ACV有较好的重叠效果.除3a外，化合物3b～3h脱保护基团后的打分分数均有增加，且3b′、3d′、3e′的分值较好.取3b′、3d′、3e′作进一步分析.如图6所示，配体3b′、3d′、3e′均与受体蛋白的Asp145、Glu81、Leu83、Lys33和Thr14氨基酸残基产生氢键相互作用.同时，这些配体还与Leu134产生π-σ键.相比前者，脱去保护基团的配体在对接时能与周围的氨基酸残基产生更多的氢键，对接效果更好，对接结果为进一步的结构修饰提供了方向.
表3 3a′-3h′与CDK2（PDBID：2A4L）的对接打分结果Tab.3 Dockingand scoringresultsof 3a′～3h′with CDK2（PDBID：2A4L）
图6 3b′、3d′、3e′与CDK2（PDBID：2A4L）的对接结果图Fig.6 Molecular dockingmodebetween 3b′、3d′、3e′with CDK2（PDBID：2A4L）
以抗病毒药阿昔洛韦为原料，与不同的氨基酸和二肽通过酰胺缩合反应合成了8个阿昔洛韦衍生物，包含7个还未见报道的化合物.所合成的产物结构通过核磁共振氢谱、碳谱、红外光谱、高分辨质谱进行表征确认.利用计算机辅助设计分子模拟对接法研究阿昔洛韦衍生物与CDK2蛋白激酶的结合情况，结果表明所设计的阿昔洛韦衍生物与靶蛋白的对接结果均优于阿昔洛韦，为进一步的结构修饰和生物活性研究提供了一定参考.
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