李欣 范宇 张彦文 钱磊
摘 要：从灭菌在医药食品行业的作用以及灭菌器原理出发，阐述脉动真空灭菌器的工作技术特点。通过温度变化及最终灭菌溶液的检测结果数据来衡量灭菌器的最小装载量验证，提供最小装载验证的可行措施，为企业生产过程中脉动真空灭菌器的验证认证提供支持。
关键词：灭菌；
灭菌器；
验证；
最小装载
中图分类号：R181.9 文献标志码：A 文章编号：1671-0797（2023）09-0063-03
DOI：10.10.19514/j.cnki.cn32-1628/tm.2023.09.018
0 引言
在医药食品领域，灭菌既是安全保障，也是生产的最基本需要。灭菌（Sterilization）是指用物理或化学方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物以及芽孢，使之达到无菌保障水平。灭菌常用的方法有化学试剂灭菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌等。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。脉动真空灭菌器采用湿热灭菌法，广泛应用于医疗食品行业，是通过蒸汽在高压环境下对物品进行灭菌的重要设备。
1 灭菌原理
微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或环境赋予菌种的抵抗力。湿热灭菌有巴氏消毒法、蒸汽灭菌法以及过热灭菌方式。其中脉动真空灭菌器的蒸汽加压灭菌和过热灭菌效果最好，脉动真空灭菌器能通过控制饱和蒸汽的温度和时间，使蛋白质变性，从而将微生物杀死，并使耐热芽孢在30 min内失去活性，从而达到灭菌的目的。现阶段，除具备灭菌功能的应用外，对某些易被高压破坏的物质，如某些糖或有机含氮化合物，通过脉动真空灭菌器控温功能将温度控制在110 ℃以下，灭菌时长15～30 min，也可达到降低微生物负载的作用。
2 法规要求
《欧盟人用和兽用药品生产质量管理规范指南》（以下简称《欧盟指南》）[1]附录提出：所有灭菌工艺都应建立经验证的装载模式，并且装载模式应定期进行再验证；
还应考虑最大装载和最小装载，作为装载验证策略的一部分。在对《欧盟指南》要求进行分析时，成都生物制品研究所有限责任公司对现有脉动真空灭菌器执行的灭菌固体、液体程序进行了梳理，并采取了相应措施。
3 脉动真空灭菌器固体、液体程序的应用
固体程序采用脉动真空方式，通过真空泵将灭菌器内室气体排出，达到脉动设定压力限度后，从夹层往内室注入饱和蒸汽，一般整个过程脉动真空三次，以彻底消除内室冷点，并在此过程中排除温度死角和小装量效应。这个过程中压力反复上升、下降，温度曲线类似于脉冲波，故命名为“脉动”[2]。固体程序主要用于不锈钢类、器械类、胶塞铝盖、塑料类材质物品灭菌，此类物品在低压和高温互相切换条件下较为稳定，不易发生形变或析出颗粒等物质。同时，在固体程序中使用大小装载模式进行灭菌，增加了灭菌次数，可能导致生产协调时间不足、浪费资源以及缩短灭菌物品寿命等问题。通过上述分析，判断固体程序采用脉动真空方式不会对所灭菌物品产生影响。
液体程序采用气体置换方式，因为液体一般放置于玻璃瓶中进行灭菌处理，若使用脉动真空方式，易将瓶内液体抽出，既损坏了待灭菌液体，又不能达到灭菌效果。置换程序主要如下：灭菌器在液体升温阶段，内室一边从夹层进入蒸汽，一边从排汽口排汽，依靠重力的作用逐渐将内室冷空气置换出去，尽可能减少内室温度死角。置换程序出气方式与脉动程序不同，有效保护了待灭菌物体，但此种方式升降温较为缓慢，灭菌时间长[3]。
4 最小装载的研究
液体程序灭菌时间长，待灭菌物品大多为培养基或生产使用的稀释液等，长时间的高温条件易使有配制浓度要求的稀释液蒸发量增大，增加液体浓度，也可能使培养基等物质失活变性。成都生物制品研究所有限责任公司生产的23价肺炎球菌多糖疫苗使用的磷酸盐缓冲液，每次用于多糖的配制，使用量约为10万mL，在《欧盟指南》[1]附录生效前，进行了最大装载量验证，且验证完成后对磷酸盐缓冲液取样进行了检测，检测项目为pH和氯化钠含量。为了响应对灭菌器最小装载的验证测试要求，增加最小装载测试的研究工作，并拟在执行装载再验证时进行应用。
首先对磷酸盐的缓冲液装载量进行评估，按照已完成最大量液体装载要求，即每次使用10个20 L玻璃瓶进行灭菌工作，对液体受热情况以及受热作用时间进行分析，并按照灭菌难易程度，得出使用1瓶缓冲液作为脉动真空灭菌器最小装载量，受热更为充分，瓶内液体蒸发理论上更为明显，故将此液体程序最小装载量设置为1瓶缓冲液，液体浓度与正常生产浓度一致，按照pH为7和氯化钠含量8.3 g/L配制磷酸盐缓冲液。将磷酸盐缓冲液配制好后，按照均匀性布点要求执行脉动真空灭菌器热分布布点，热分布点位布置如图1所示。
在热分布点位布置完成后，根据实际情况，对最小装载进行热穿透探头布置，布置点位信息如图2所示。
针对最小装载验证工作，在进行验证测试前，按照药品管理指南规范（现行版）要求，完成脉动真空灭菌器验證测试前的准备工作，进行BD测试、保压测试、验证用探头的前校准工作，滤器在线SIP、空载热分布测试。上述测试完成以后，进行最小装载的热分布和热穿透（指示剂布点）测试，在验证结束后还应对验证用的探头进行后校准工作。其他测试项目如报警联锁功能测试，可根据测试过程发生情况进行记录，或穿插在上述测试中进行。
按正常生产模式，设置脉动真空灭菌器液体灭菌程序：置换1 800 s，灭菌时间3 000 s，灭菌温度121.0 ℃，内室压力限度110～120 kPa，夹层压力限度90～120 kPa；
将探头放置于液体内部进行连续3次热穿透测试，抽取样品送检进行检测，获得pH和氯化钠结果如图3所示。
经测试，探头放置于液体内部，液体受热蒸发温度和时间均接近，磷酸盐缓冲液pH和氯化钠浓度均在内控要求的合格范围内，pH合格范围为6.0～7.5；
氯化钠含量合格范围为7.6～10.0 g/L。由图3可知，氯化钠含量没有变化，pH值接近一致，但略偏低，证明最小装载测试有效，控制探头放置于液体内部，液体受影响较小或无影响。
为确认是否因为探头放置因素导致蒸发量发生变化，对脉动真空灭菌的探头位置进行调整，此次探头放置于液体外部，比较3次最大和最小液体装载测试结果，如图4所示。
经测试，探头放置于液体外部，液体受热蒸发温度和时间产生差异，磷酸盐缓冲液pH和氯化钠浓度虽在内控要求的合格范围内，但氯化钠和pH含量因蒸发时间有异，均发生了变化，氯化钠含量升高，pH值略偏低，虽均在可控范围，但已出现时间和温度差异影响。
5 研究总结
经研究，若脉动真空灭菌探头放置于液体内部，灭菌时长约4.5 h（自升温开始到灭菌结束可开门情况）；
而探头放置于液体外部，灭菌时长约2 h。磷酸盐缓冲液受温度作用时间和液体蒸发因素影响，因装载量不一致，整个灭菌时长不一，导致结果存在差异。
经过结果及液体性质分析，磷酸盐溶液具有自我调节pH功能，无论大小装载，pH结果均在合格范围内，且变化较小；
氯化钠溶液因灭菌时长不一，大小装载受热蒸发程度不同，最小装载因蒸发量过多，虽灭菌后的氯化钠浓度在合格范围内，但可能引起浓度升高等异常情况。同时，为避免因灭菌原因导致作用后的液体不符合要求，将温度探头放置于液体内部灭菌，是最符合条件也是最准确的灭菌方法。
6 探索与展望
灭菌是获得无菌的必要条件，也是食品工业和医药领域不可或缺的技术。高压锅的验证、不同液体装载模式的探索，灭菌所涵盖的内容也比较广泛，温度条件、作用时间、冷热锅的启动等都是需要探讨与研究的问题。因此，成都生物制品研究所一直以来都力求及时跟进法规要求，为中国疫苗企业做好带头示范作用，积极奋进，为中国第一支走出国门的疫苗继续把好质量关。
[参考文献]
[1] 欧盟委员会.欧盟药品管理规则 第4卷 欧盟人用和兽用药品生产质量管理规范指南[S].
[2] 韩昆，宋宁科，刘凯.新华XGI-DM型脉动真空灭菌器原理、维护保养及故障处理[J].医疗装备，2013，26（3）：90-91.
[3] 蔺建平，郭建军，亢和平，等.浅谈脉动真空灭菌柜脉动灭菌和非脉动灭菌模式的不同及使用要點[J].中国新技术新产品，2022（3）：64-66.
收稿日期：2022-12-27
作者简介：李欣（1986—），男，辽宁铁岭人，工程师，研究方向：生产工艺设备类验证。
通信作者：钱磊（1988—），男，四川叙永人，工程师，研究方向：质量管理。
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