王 月 任梓铭 陆 珠 于延申 田 松 迟翔丹 宫庆瑞 耿 伟
（吉林省蔬菜花卉科学研究院，吉林长春 130000）
甘蓝色膜褶菌Hymenopellis raphanipes（Berk.）R.H.Petersen，隶属于担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、伞菌目Agaricales、膨瑚菌科Physalacriaceae、膜褶菌属Hymenopellis[1]，又名长根菇、长根小奥德蘑、鳞柄小奥德赛蘑等[2]，外形酷似野生鸡菌，商品名为黑皮鸡，是近年来商业化栽培的热门食用菌[3]，享有“食用菌女王”的美誉[4]。野生甘蓝色膜褶菌夏秋季单生或群生于阔叶林中地上，其假根着生于地下腐木或腐殖层上，为木腐型真菌，在我国多分布于滇、粤、闽、桂、川等地，属中高温型食用菌[5]。该菌味道鲜美，含有丰富的营养物质，如蛋白质、氨基酸、脂肪、维生素和微量元素等，所含的长根菇素具有降压功效[6]。
国内栽培甘蓝色膜褶菌的历史较短，2007 年在山东济宁首次栽培成功[7]，2013 年实现周年生产[8]。目前，我国多地（山东省、四川省、广东省、湖南省等）人工栽培甘蓝色膜褶菌已具一定规模[9]，但在吉林省栽培面积小，产量少且质量不稳定，无法满足市场需求。笔者对甘蓝色膜褶菌子实体进行组织分离及分子生物学鉴定，探索不同碳氮源、温度及pH对其菌丝生长的影响，筛选出适合其生长的营养及环境条件，为培育高质量甘蓝色膜褶菌菌丝，实现规模化生产提供理论依据。
1.1 试验材料
（1）供试菌株：甘蓝色膜褶菌菌株（编号为OUE）保藏于吉林省蔬菜花卉科学研究院食用菌研究所，子实体采自吉林省菇乡生物科技股份有限公司出菇温室（图1）。
图1 甘蓝色膜褶菌子实体
（2）培养基：菌株活化培养基为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氢钾3 g，七水硫酸镁1.5 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH自然。基础培养基为葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，琼脂20 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH自然。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株分离与纯化
采用组织分离法分离纯化菌株。选择菌盖肥厚、无病虫害的子实体，用无菌水清洗表面污物，再用75%乙醇消毒表面，用手术刀纵向切开子实体，在菌盖、菌柄交界处取0.5 cm✕0.5 cm 菌肉组织，移入菌株活化培养基（斜面）中央，恒温25 ℃黑暗培养。定期观察菌丝生长情况，待菌丝长至培养基斜面1/2 处时，挑取菌落边缘新生菌丝至平板培养基中央培养后，连续转接3次，即获得纯化菌株。
1.2.2 ITS序列测定
用DNA 提取试剂盒（试剂盒购于北京酷来博科技有限公司）进行基因组DNA提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量和浓度。PCR 扩增用真菌ITS通用引物ITS1 和ITS4，在BioRad My Cycle 型PCR仪上进行扩增，反应体系见表1，程序设定见表2。
表1 PCR反应体系
表2 程序设定
测序结果提交至NCBI 数据库，BLAST 在线比对，用Mega 6.0 软件中的Neighbour-Joining 法构建系统发育树。
1.2.3 培养基碳源筛选试验
用等质量的可溶性淀粉、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖代替基础培养基中的葡萄糖，配制含不同碳源培养基，以基础培养基为对照（CK）。用灭菌打孔器（直径7 mm）取相同菌龄的菌种块，接种于含供试碳源培养基平皿中央，每处理3 次重复，25 ℃避光培养。菌丝萌发后测量菌落直径（十字交叉法），至菌丝长满平板或停止生长为止，记录菌丝形态及计算菌丝长速。
菌丝平均生长速度（mm/d）的计算公式：
公式中D表示菌落直径（mm），d表示培养时间（d），7是接种块直径。
1.2.4 培养基氮源筛选试验
用等量的尿素、硝酸钾、硫酸铵、牛肉膏、酵母浸膏为氮源代替基础培养基中的蛋白胨，配制含不同氮源的培养基，以基础培养基为对照（CK）。菌丝的培养及生长速度的测定计算方法同1.2.3。
1.2.5 培养温度筛选试验
用7 mm灭菌打孔器取菌龄相同的菌种块，接种于基础培养基平皿中央，分别置18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃的恒温培养箱中避光培养，每处理3 次重复。菌丝生长速度的测定计算方法同1.2.3。
1.2.6 培养基pH筛选试验
用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 将基础培养基的pH 分别调至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，高压灭菌冷却后接种试验菌株，25 ℃避光培养，每处理3 次重复。菌丝生长速度的测定计算方法同1.2.3。
1.3 数据分析
采用Excel及DPS7.05统计软件分析数据。
2.1 分子鉴定结果
测序结果在NCBI 数据库中进行BLAST 比对，与已知序列KX688247Hymenopellis raphanipes的同源性高于99%。以MH877768Psathyrella candolleana作为外类群，选取10 个同源性较高的序列，与OUE一起构建系统发育树（图2）。由图2可知，供试菌株与Hymenopellis raphanipes序列聚为一类，Psathyrella candolleana单独存在于一个分支。分子生物学水平鉴定结果，试验菌株OUE为甘蓝色膜褶菌。
图2 基于ITS rDNA序列的NJ系统发育树
2.2 碳源筛选结果
由表3可知，OUE菌株在供试碳源培养基上，菌丝生长速度（平均生长速度，下同）无显著差异，但菌丝长势有所不同。在碳源为果糖的培养基上菌丝生长速度最快，为8.54 mm/d，在碳源为乳糖的培养基上菌丝生长最慢，仅4.5 mm/d。在以果糖、麦芽糖、可溶性淀粉为碳源的培养基上，菌丝长势最浓密，在含蔗糖、葡萄糖培养基上次之，在含乳糖培养基上最稀疏。综合菌丝生长速度和长势，培养菌株OUE的培养基最佳碳源为果糖，其次为麦芽糖。
表3 供试碳源培养基培养甘蓝色膜褶菌菌丝生长情况
2.3 氮源筛选结果
OUE 菌株在以尿素为氮源的培养基上不能生长，在含其他氮源培养基上菌落均呈绒毛状，白色，圆形。由表4可知，在含供试氮源培养基上，OUE菌株菌丝生长速度为4.7～8.02 mm/d，在酵母浸膏培养基上生长速度最快，为8.02 mm/d，但与含硝酸钾、CK 培养基上菌丝生长速度无显著差异，与含牛肉膏、硫酸铵培养基上菌丝长速差异显著，含硫酸铵培养基上菌丝长速最慢（4.7 mm/d）。在含酵母浸膏或硫酸铵培养基上菌丝浓密，但在硫酸铵培养基上菌丝长速显著慢于酵母浸膏，硝酸钾、CK、牛肉膏次之。综合菌丝长势、生长速度，OUE 菌株菌丝培养基的最佳氮源为酵母浸膏。
表4 供试氮源培养基培养甘蓝色膜褶菌（OUE）菌丝生长情况
2.4 培养温度筛选结果
由表5 可知，培养温度18～24 ℃菌丝长速随着培养温度的升高而加快，但温度继续升高后，菌丝长速呈下降趋势。培养温度，24 ℃、26 ℃、28 ℃菌丝长速无极显著差异。培养温度24 ℃、26 ℃，菌丝长势最浓密，20 ℃、22 ℃、28 ℃菌丝长势次之，18 ℃、30 ℃下菌丝长势最弱，菌落稀疏。综合菌丝长势和生长速度，24～26 ℃是OUE 菌株菌丝最适生长温度范围。
表5 不同培养温度下甘蓝色膜褶菌（OUE）菌丝生长情况
2.5 培养基pH筛选结果
由表6可知，OUE 菌株菌丝在试验pH 培养基上均能生长，且菌丝长势及菌落形态均无显著差异。菌丝生长速度依次为pH5.5＞pH6.0＞pH5.0＞pH7.0＞pH9.0＞pH6.5＞pH7.5＞pH8.5＞pH4.5＞pH8.0。培养基pH5.5，菌丝生长速度最快，为7.38 mm/d，培养基pH8.0，菌丝生长速度最慢，仅4.54 mm/d。培养基pH 为5.0、5.5和6.0时，菌丝长速无极显著差异。综合菌丝长势和生长速度，OUE 菌株菌丝培养基的最适pH为5.5～6.0。
表6 不同pH培养基培养甘蓝色膜褶菌菌丝生长情况
分子生物学鉴定结果，供试OUE 菌株与Hymenopellis raphanipes的同源性高于99%，与下载的Hymenopellis raphanipes序列聚成一类，确定OUE 菌株为甘蓝色膜褶菌Hymenopellis raphanipes。
甘蓝色膜褶菌菌株OUE 菌丝培养基的最佳碳源为果糖，其次为麦芽糖，与谭伟等[10]、徐兵等[11]的研究结果一致；
在乳糖为碳源的培养基上，菌丝平均长速为4.50 mm/d，与李建宗[12]的研究结果（在有乳糖的培养基上完全不能生长）不同；
OUE 菌株菌丝培养最佳氮源为酵母浸膏，不能在以尿素为氮源的培养基上生长，与谭伟等[10]、李建宗[12]、张磊等[13]、熊雪等[14]的研究结果一致；
OUE 菌株菌丝生长最适温度为24～26 ℃，最适培养基pH 为5.5～6.0，与罗影等[15]的研究结果一致，但与张磊等[13]得出的最适pH为7.0的研究结果不同。
甘蓝色膜褶菌的菌丝培养特性因菌株而异，而培养基的碳氮比对菌丝生长影响显著，笔者未进行碳氮比研究，今后应进行培养基的最佳碳氮比探索。研究为培育高质量甘蓝色膜褶菌菌丝，实现其规模化生产提供理论依据。
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