刘 鑫，张梦佳，郝 晴，王艳雪，孙 晴*，马敬国
（1.临沂大学医学院，山东 临沂 276000；
2.山东省平邑县畜牧发展促进中心，山东 平邑）
临沂市某羊场根据流行病学调查怀疑感染肺炎支原体，本实验对送检病料进行支原体的分离培养，并作形态学观察及免疫荧光鉴定，确诊为羊支原体肺炎。羊支原体肺炎是丝状支原体感染引起的一种高度接触性呼吸道传染病，根据其临床症状和病程可分为最急性、急性和慢性肺炎。随着养殖规模的扩大以及养殖密度的提高，羊疫病的发生也越来越频繁，严重威胁着羊群的健康生长，甚至给养殖户造成较大的经济损失[1-2]。目前首选药物常为抗生素类药物，但此类药物长期使用会产生耐药性进而导致治疗效果不佳[3]。在中医临床中针对羊支原体肺炎的治疗主要是以清热解毒、宣肺祛痰和消食理气为主。研究成员对麻杏石甘汤[4]和清肺通络方[5]进行辩证加减组方[6]，在此基础上再结合现代科技制备成中药喷雾剂，发挥药效的同时方便给药途径。该研究对中药喷雾剂的研制不仅适用于羊肺炎支原体感染，同时为其他动物和人肺炎支原体感染的防治提供新思路，为中药新剂型的开发提供参考。
1.1 材料
1.1.1 试剂 支原体基础培养基、支原体琼脂培养基，购自海博生物技术有限公司；
灭菌马血清、姬姆萨染液，购自美谷生物科技有限公司；
细菌微量生化鉴定管、抗菌药物药敏试纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。
1.1.2 中药材 麻黄、杏仁（去皮尖）、甘草、石膏、连翘、黄芩、金银花、桔梗均由中药学实验室提供。
1.1.3 样本 患病羊咽拭子、血清、心、肺。
1.2 方法
1.2.1 临床症状 病羊临床症状主要表现为高热、咳嗽、食欲不振、精神萎靡、消瘦、生长发育缓慢。特征性剖检变化是胸和胸膜发生浆液性与纤维素性炎症，其中最急性型主要表现在体温突然升高（达41 ℃ 以上），且采食基本废绝，呼吸困难，每次呼吸都伴随全身肌肉颤动，持续3 d 左右就会死亡；
急性型也伴随着体温升高，同时还会不断的咳嗽，并从湿咳转变为干咳，并伴随有浆液性鼻漏，治疗不及时大多数情况下会在15~30 d 后死亡；
慢性型的症状比较轻微，大多数病羊身体虚弱，营养不良，虽然死亡率并不高，但是有可能会因为继发感染出现死亡（图1）。
图1 发病羊群的临床症状
1.2.2 羊肺炎支原体的分离培养 （1）取病料无菌接种支原体液体培养基，于37 ℃ 含有5 %CO2的恒温培养箱培养3～5 d，液体由红变黄且浑浊为长菌现象。（2）将上述菌液1:10 稀释，取1 ml 稀释液涂布于支原体琼脂培养基，于37 ℃含有5 % CO2的恒温培养箱培养3～5 d。瑞氏姬姆萨染液染色显微镜观察。
1.2.3 生化鉴定 选用生化鉴定管：葡萄糖、尿素、蕈糖、甘露糖、果糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、硝酸盐，对分离的羊肺炎支原体进行生化试验。
1.2.4 羊肺炎支原体对抗生素敏感性试验 取100 µl 菌液于1 ml 生理盐水中均匀涂布于支原体琼脂培养基，取药敏片贴到平皿培养基表面，同培养基等距贴6 张药敏纸片（四环素、环丙沙星、红霉素、卡那霉素、左氧氟沙星、恩诺沙星），于37 ℃含有5 % CO2的恒温培养箱中放置培养3～5 d，后测抑菌圈的直径大小。
1.2.5 中药喷雾剂的制备 （1）组方。根据麻杏石甘汤[4]和清肺通络方[5]辩证加减方：麻黄9 g、杏仁（去皮尖）5 g、甘草 6.5 g、石膏9.5 g、连翘15 g、黄芩9.5 g、金银花15 g、桔梗15 g。（2）中药喷雾剂浓缩液的配制。称取药材1:8 纯水浸泡2 h-水浴加热回流2 h，留滤液-剩余药渣1:6 继续回流并浓缩，至药材重量与浓缩药液体积比为 0.6~2 g/ml-药液 1:6 的 80 %（V/V）乙醇中，静置沉淀1 h，滤过；
滤液回收乙醇，浓缩滤液至药材重量与浓缩药液体积比为0.6~1.1 g/ml，即得浓缩液。（3）中药浓缩液抑菌试验。制备不同浓度药液的药敏纸片进行一次抑菌试验，于相同条件下再进行两组重复试验。药敏试纸的制备：用打孔机将定性滤纸制作成直径为6 mm 的圆形滤纸，分装到5 支干燥洁净的小玻璃瓶内，10 片/瓶，放入高压蒸汽灭菌，再放入80 ℃ 干燥箱烘干备用。将浓缩液倍比稀释（1:1、1:2、1:4、1:8、1:16 共五组药液），各取1 ml 于无菌EP 管，每支中放入10 片圆形滤纸，浸泡24 h。筛选抑菌圈最大的浓度为最适浓度用于制备喷雾剂。（4）中药制剂与抗生素药物抑菌效果比较。1.2.4 试验中选取敏感药物四环素和环丙沙星和中药试纸片敏感组进行药敏实验比较。（5）中药喷雾剂的制备及质量控制。①取最适浓缩液，加入99 % 的甘油1:10 稀释，搅拌药液至澄清状态，加入对羟基苯甲酸乙酯作为防腐剂配制成合规药液。灌封于灭菌的不透明金属瓶内，安装手动泵既得。②喷雾剂的质检：外观和装量差异检查；
粒度检查；
每喷喷量检查；
微生物限度检查，均应符合药品质量标准。
1.2.6 药效试验 将制备的喷雾剂交由养殖场工作人员，由养殖人员对患病羊进行喷鼻，2 次/d，每次5 喷，连续给药10 d，每天观察治疗效果。
2.1 形态学鉴定
肺炎支原体于固体培养基中肉眼可见，菌落大小如针尖，细小光滑，圆形（图2A），将培养基倒置于光学显微镜下观察菌落为球形、边缘钝圆，无中间脐，成熟菌落变为淡黄色乃至棕黄色（图2B），因革兰氏染色着色不佳，选用瑞氏姬姆萨染色后油镜下多为淡紫色且多呈杆状、分支丝状（图2C），与报道描述一致。
图2 形态学观察
2.2 生化鉴定
生化鉴定结果显示，分离的肺炎支原体分解葡萄糖产酸不产气，不能分解尿素的生物学特性（表1）。
表1 生化鉴定结果
2.3 药物对羊肺炎支原体的抑制试验
2.3.1 羊支原体对抗生素敏感性试验结果 本药敏试验选用临床常用药物的药敏试纸片，结果表明，四环素、环丙沙星、左氧氟沙星、恩诺沙星药物对羊肺炎支原体的抑制作用较强，而红霉素无效（图3，表2）。
表2 羊支原体对抗生素药敏试验结果
2.3.2 不同浓度中药浓缩液抑菌试验结果 通过三次平行试验，对比五组不同浓度的中药浓缩液的抑菌圈直径大小。结果显示药液三组1:4 稀释对羊肺炎支原体有最大抑制作用（图3，表3）。
表3 不同浓度药物浓缩液抑菌试验结果
图3 不同浓度中药浓缩液三次平行药敏试验结果（A、B、C）
2.3.3 中药制剂与抗生素药敏试验比较 根据2.3.1 和2.3.2 实验结果筛选对肺炎支原体敏感抗生素四环素、环丙沙星与中药浓缩液（1:4）作对照试验，结果显示所制中药浓缩液抑菌效果稳定，且与临床用于治疗支原体肺炎的抗生素效果相当（图4）。
图4 中药和抗生素药敏试验结果
2.4 药效试验
连续给药10 d 后，患病羊群体温恢复正常值，咳嗽症状明显减轻，浆液性鼻汁症状缓解，食欲、精神恢复，毛色较发病时有光泽。
大环内酯类抗生素是治疗羊支原体肺炎的首选药物，但是抗生素的耐药性现象日益突出，国内也开发出了一系列中草药制剂用于畜类的治疗，但治疗多采取口服、肌肉注射等途径给药，口服给药剂量大，因中药靶点并非西药那么明确，极易产生首过效应，药物在胃肠道易被破坏；
肌肉注射药物生物利用度低，影响药效，口服给药或注射均较难起效。喷雾剂本身具有独特的剂型优势，可避免首过效应，并具有制备简单、起效快、剂量小、使用安全方便的特点，随着制剂新技术的发展和质量控制水平的提高，中药喷雾剂可充分发挥传统中医药的特色，促进中药的二次开发，创造更大的社会效益和经济效益[7-8]。
在本试验中制备的中药喷雾剂直接作用于羊的呼吸道黏膜，药物分布均匀，起效快，适用于呼吸系统疾病，极大方便给药。因病料样本较少实验结果不够全面，实验室制备样本数量及规格对于羊群大规模治疗存在局限性，但新中药组方制成的喷雾剂对羊肺炎支原体有较为良好的抑制作用，后续可以尝试扩大生产规模并应用到其他患病动物，为动物感染肺炎支原体的治疗提供技术支撑，减少养殖业的的经济损失。
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