郭宾，蒋悦，李雅善,3，梁艳英，段冰冰，刘旭*
（1. 五粮液仙林生态酒业有限公司，四川宜宾 644007；
2. 西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；
3. 楚雄师范学院资源环境与化学学院，云南楚雄 675000）
高品质的红葡萄酒具有令人愉悦的颜色和口感。缩合单宁和花色苷作为葡萄酒中一类重要的酚类物质，其含量和结构特性对葡萄酒感官质量，如色泽、澄清度、风味、收敛性，以及稳定性、陈酿潜力等都具有重要影响[1-2]。在红葡萄酒陈酿过程中，由于花色苷和缩合单宁被缓慢氧化，不仅使红葡萄酒的苦涩味和粗糙感逐渐降低或消失，还使其结构感、圆润感逐渐增强；
在此过程中，红葡萄酒的颜色逐渐由鲜艳的宝石红色变为橙红色，最后变为砖红色或瓦红色[3]。因此，葡萄酒花色苷和缩合单宁的特性影响着葡萄酒的色泽和口感特性，进而影响葡萄酒的品质。近年来，外源酿酒单宁产品的应用较为广泛，其对葡萄酒品质的影响也成为研究热点之一[4-6]。研究认为，商品化的葡萄酒酿制专用优质单宁TRS（Taniraisin）和VVR（Vitanil VR）既可以保护红葡萄酒的颜色，又可提升葡萄酒的醇厚口感和酒体结构，也不会对葡萄酒产生负面影响[7]。酿造‘蛇龙珠’干红葡萄酒时，通过添加VVR可使葡萄酒颜色呈深宝石红色，色调较深，果香浓郁，口感圆润，酒体结构饱满[8]。优质单宁产品“优酿丹”在改善葡萄酒结构、提升口感、稳定色度等方面具有显著作用和突出优点[9]。陈光等[10]发现，添加单宁（TRS或VVR）有助于形成花青素-单宁-甘露糖蛋白，可使葡萄酒颜色更加稳固，从而提高葡萄酒的陈酿潜力。
我国葡萄酒产区主要位于大陆性季风气候区，酿造的葡萄酒颜色稳定性和口感浓郁度相对较弱。目前，国内已有部分企业在酿酒过程中添加外源单宁，但相关研究多集中在对葡萄酒的香气和口感方面[5,11]，对花色苷和缩合单宁特性的研究较少。本试验结合我国葡萄酒生产实际，以酿酒葡萄‘赤霞珠’为材料，采用传统干红葡萄酒酿造工艺，通过添加外源单宁Tannin VR Supra和Tannin VR Color，分析外源单宁对葡萄酒花色苷和缩合单宁特性的影响，旨在为优质葡萄酒的生产提供参考。
1.1 试验处理
供试品种为‘赤霞珠’，2019年9月13日采摘于商业葡萄园（108°69′ N、34°60′ E）。所采果穗健康均匀，成熟度一致，达到了商业成熟期。葡萄采收当天立即送往西北农林科技大学葡萄酒学院中试车间，采用20 L玻璃罐进行小容器发酵。入罐后立即加入60 mg·L-1SO2及20 mg·L-1果胶酶，随后在冷库内（2 ℃）低温浸渍48 h，取葡萄汁作为第一次待测样品（9月15日）。然后，在25±2 ℃条件下添加活化酵母，每天监测3次葡萄醪的比重变化，待比重降至0.998时进行皮渣分离，并在比重降至0.994时进行苹果酸-乳酸发酵。苹果酸-乳酸发酵结束后（10月1日）将葡萄酒密封，置于10 ℃环境下进行陈酿，并每隔1个月取样测定花色苷和缩合单宁特性。
外源单宁分别为Tannin VR Supra（鞣酸单宁，LAFFORT，法国，主要用于保护葡萄酒的颜色不被氧化，TS）、Tannin VR Color（儿茶酚单宁，LAFFORT，法国，对葡萄酒颜色起到稳定效果，TC）。酿造期间，根据外源单宁添加的时间和种类共设置3个处理，即（1）TS处理：葡萄醪入罐后，添加0.2 g·L-1的TS；
（2）TC处理：比重降至1.030时，添加0.20 g·L-1的TC；
（3）TS＋TC处理：葡萄醪入罐后添加0.20 g·L-1的TS，比重降至1.030时添加0.20 g·L-1的TC。以不添加外源单宁为对照（CK），每组处理设置3个重复。
1.2 仪器与设备
主要仪器与设备包括：PAL-1数显手持式折光仪：东京，Atago公司；
高速冷冻离心机：长沙，湘仪离心机仪器有限公司；
高效液相色谱仪：美国，安捷伦1260型；
冷冻干燥机：北京，FD-IC-50型；
真空泵：郑州，SHB-3X型。
1.3 试验方法
1.3.1 基本理化指标测定
葡萄与葡萄酒基本理化指标分析参考《葡萄酒分析检验》[12]进行。
1.3.2 花色苷提取与测定
果皮花色苷提取参考He等[13]的方法进行。准确称取0.50 g葡萄果皮，加入10 mL含有2%甲酸的甲醇溶液，避光超声提取，取上清液于50 mL离心管中，重复上述提取步骤3次。将收集的提取液浓缩至干，残渣用10 mL甲醇定容，用0.45 μm有机滤膜过滤后进行检测。花色苷物质采用Shimadzu LC-20AT HPLCDAD进行定量分析。单体花色苷的含量以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷计算，定量方法根据相关物质的标准曲线进行计算，结果以mg·L-1表示[14]。葡萄酒样直接经0.45 μm有机滤膜过滤后按上述方法进行检测。
1.3.3 缩合单宁的提取与测定
缩合单宁特性测定参考Kennedy & Jones[15]的方法进行。分别剥取果皮和种子，冻干称重后放入三角瓶中，加入66%（Vol）丙酮水溶液，冲入氮气，封口后避光震荡提取24 h，收集提取液于38 ℃旋蒸去除丙酮，用去离子水定容至100 mL；
取9 mL提取液浓缩至干后用3 mL甲醇溶解，冲入氮气，﹣20 ℃避光保存。9 mL酒样经HyperSep C18固相萃取后，将得到的洗脱液于35 ℃下减压蒸发至干，加入1 mL甲醇溶解残渣，﹣20 ℃贮藏备用。
采用间苯三酚法（Phloroglucinolysis）测定缩合单宁含量、亚基组成及比例、酯化程度（G）、平均聚合度等。取200 μL提取液与等体积间苯三酚溶液反应后加入1 mL 40 mmol醋酸钠溶液终止反应，过0.45 μm有机滤膜后上机测定。检测条件为：分析柱Chromolith RP-18e（100 mm×4.6 mm），保护柱Purospher STAR RP-18e（4 mm×4 mm，5 μm）。流动相A为1%（Vol）乙酸溶液，流动相B为含有1%乙酸的乙腈溶液；
洗脱梯度为流动相B，0 min，3%；
4 min，3%；
14 min，18%；
14.01 min，80%；
16 min，80%；
16.01 min，3%；
18.0 min，3%。检测波长280 nm，柱温30 ℃，流速3.0 mL·min-1。外标法定量，标准品为(-)-表儿茶素。
1.4 数据处理
数据采用SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, USA）分析软件进行统计分析。采用Duncan新复极差检验和独立样本T检验进行处理间的差异显著性检验，差异显著水平为P≤0.05。采用Origin Pro 2016（IBM Corporation, New York, USA）进行绘图。
2.1 ‘赤霞珠’葡萄基本理化特性分析
试验所选用的‘赤霞珠’葡萄原料还原糖为197.37 g·L-1，可滴定酸为6.08 g·L-1，可溶性固形物含量为22.03%，pH值为3.95，粒质量为0.91 g。葡萄品质良好，适宜酿造干红葡萄酒。
2.2 葡萄花色苷和缩合单宁组分及含量分析
‘赤霞珠’葡萄果实花色苷和缩合单宁组分及含量的测定结果见表1。‘赤霞珠’葡萄果皮检出的主要花色苷有9种，以二甲花翠素类花色苷物质为主。含量较高的单体花色苷为二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（Mv）、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰)-葡萄糖苷（Mv-acet）和二甲花翠素-3-O-(6-O-反式对香豆酰)-葡萄糖苷（tMv-coum），含量分别为810.43、718.36、216.33 mg·L-1；
其次为甲基花青素-3-O-(6-O-乙酰)-葡萄糖苷（Pn-acet），甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷（Pt），甲基花青素-3-O-葡萄糖苷（Pn），花翠素-3-O-葡萄糖苷（Dp），甲基花青素-3-O-(6-O-反式对香豆酰)-葡萄糖苷（tPn-coum）；
而花青素-3-O-葡萄糖苷（Cy）则在‘赤霞珠’葡萄果皮中含量最低，仅为9.32 mg·L-1。
表1 ‘赤霞珠’葡萄果实花色苷和缩合单宁组分Table 1 Anthocyanin and tannin properties in the skins and seeds of "Cabernet Sauvignon"
葡萄原料中的缩合单宁组分及含量决定了葡萄酒的感官特性。本研究中‘赤霞珠’果实的果皮和种子，以及两者的延伸亚基（-E）和末端亚基组分（-T）之间的缩合单宁特性均存在差异。果皮和种子中的延伸亚基均由儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）4种组分构成，而末端亚基则不包含EGC。对比果皮和种子中延伸亚基和末端亚基中的不同组分可以发现，果皮的延伸亚基EGC、EC显著高于种子，其它延伸亚基及末端亚基组分均为种子显著高于果皮。值得注意的是，种子中延伸亚基不含有EGC。果皮和种子中延伸亚基EC均占比最高，分别达到67.16%和49.76%。种子中的缩合单宁没食子酰化比例和缩合单宁含量均显著高于果皮，而果皮中缩合单宁平均聚合度和分子量均显著高于种子。
2.3 添加外源单宁对葡萄酒基本理化指标的影响
苹果酸-乳酸发酵结束并陈酿30 d后（2019年11月1日）取各酒样进行葡萄酒基本理化指标检测。结果发现，添加外源单宁处理后‘赤霞珠’葡萄酒的基本理化指标均符合GB/T 15037—2006标准，见表2。各处理间检测的还原糖、酒度、总酸、挥发酸和pH均无显著性差异，这表明添加TC与TS处理对‘赤霞珠’葡萄酒基本理化指标无显著影响。
表2 添加外源单宁对‘赤霞珠’葡萄酒基本理化指标的影响Table 2 Influence of exogenous tannins on physical and chemical properties of "Cabernet Sauvignon" wine
2.4 添加外源单宁对葡萄酒花色苷的影响
由表3可知，‘赤霞珠’葡萄醪和葡萄酒中含量最高的花色苷为Mv，其次为Mv-acet和tMv-coum。添加TS并经冷浸渍48 h（2019年9月15日）的葡萄醪各花色苷含量较CK低，但差异不显著。总体而言，葡萄酒陈酿过程中Dp、Cy、tPn-coum和tMv-coum的含量逐渐降低，而Pn、Mv、Pn-acet和Mv-acet含量逐渐增加。陈酿过程中，TS处理葡萄酒中Dp、Mv-acet、tPn-coum和tMv-coum含量显著高于TC和TC＋TS处理，其与CK无显著性差异，但Cy含量显著低于CK；
TC较其他处理显著降低了tPn-coum和tMv-coum含量；
TC＋TS显著降低了Cy和Mv-acet含量。
-1 mg·L量含总0.28±49.19a 59 5.88±22.42a 47 5.29±10.30a 52 1.77±40.39a 52 9.58±54.24a 47 7.65±55.14a 50 562.54±5.22a 1.32±27.03a 59 9.07±44.22a 52 5.77±43.98a 51 586.36±2.55a 5.88±28.19a 63 1.97±17.47a 58 7.14±45.78a 54"vignon au响f "Cabernet S影的苷wine o色花体ust and单中酒s in m萄an in葡及醪萄葡er anthocy’珠onom霞赤n m‘对理处同3 不表Influence of different treatments o Table 3花-(6-O-翠 豆苷甲-O对萄香糖二-3式)-葡v-coum素反酰tM花-(6-O-青 豆糖基-O对香萄甲-3式)-葡n-coum tP素反酰苷-)--3素酰苷二O-(6-O萄翠-乙糖花甲葡Mv-acet花-(6-O-青 萄基甲-3-O)-葡-acet Pn素乙糖酰苷翠萄二-3-O苷花-葡Mv甲素糖青-葡Pn基-3花-O苷甲素糖萄翠花-葡萄Pt 基甲-3-O苷糖素--3-O Cy素糖苷青萄花葡--O Dp-3素糖苷翠萄花葡4.22a 31.27±0.47a 3.3±0.02±11.51a 15 6.34±0.61a a 353.74±29.82 6.99±0.12a 1.39a 3±.3 21 3.82±0.47a 0.84a 8±.4 13 2.67a 28.48±3.33±0.21a 4a.0 123.63±4 5.84±0.30a a 275.99±13.70 6.71±0.54a 0.63a 9±.2 17 2.86±0.43a 0.05a 11.76±1.37a 22.56±.11b 2.20±0 0a.2 127.98±3 3.98±0.12c 9a.8 339.54±7 6.15±0.47b 0.41a 4±.2 15 2.55±0.07a 5.10±0.25a 4.15a 26.41±7ab.2 2.68±0 0a.3 133.16±9 0.57b 3±.4 10 a 318.26±24.76 6.58±0.42b 1.23a 2±.5 15 2.60±0.03a 6.13±0.86a 2.69a 19.83±2.15±0.14b 5.53±11.62a 12 3.33±0.24c a 305.06±37.05 2.20±0.08c 1.87a 3±.9 13 2.15±0.13b 5.39±0.88a 4.46a 25.61±2.95±0.30a a 128.05±12.84 0.09a 11.47±8.81a 311.18±3 8.16±0.71a 2.49a 4±.6 14 1.29±0.14c 4.30±0.14a 1.12ab 5±.8 22.11a 2.67±0 8a.4 144.14±3 0.2a 12.65±7a.7 348.75±1 8.13±0.77a 0.42a 6±.1 15 2.85±0.21a 5.35±0.2ab 3.09a 30.94±3.21±0.32a 8a.3 154.07±4 0.64a 6±.4 13 a 357.01±18.31 7.81±0.55a 0.87a 17.11±1.68±0.05b 6.02±0.26a 2.24b 20.66±2.54±0.14a 1a.2 144.83±9 0.96a 7±.9 10 a 321.83±28.78 7.88±0.87a 1.67a 0±.2 14 9bc.0 1.38±0 4.77±0.64b 25.2±3.95ab 2.73±0.21a 8.23±11.53a 13 1.24a 11.77±a 312.13±29.99 6.29±0.14a 0.77a 9±.5 13 1.25±0.07c 4.57±0.06b 0.9ab 23.42±2.38±0.08b 152.44±2.38ab 0.18a 11.85±7a.8 363.93±1 8.29±0.08a 0.27a 9±.0 16 2.23±0.31a 5.73±0.41a 3.02a 31.85±3.01±0.24a 2a.5 170.84±5 0.50a 9±.8 10 a 384.75±17.87 7.34±0.98a 0.90a 9±.7 18 4ab.0 1.73±0 6.68±0.23a 2.40b 20.76±2.24±0.18b 159.84±2.52ab 1.10a 1±.8 10 7.41±11.10a 35 7.03±0.67a 0.67a 8±.4 16 2.22±0.10a 5.18±0.66a 4.21ab 2±.0 26 6ab.0 2.59±0 7.74±11.15b 14 1.22a 7±.4 10 a 328.54±30.81 6.78±0.21a 1.29a 2±.5 17 1.47±0.19b 6.00±0.95a理ent处Treatm CK TS 2019-9-15 CK TS TC-11-01 2019 C+T TS CK TS TC 2019-12-3 C+T TS CK TS TC 1-09 20-0 20 C+T TS
陈酿至2020年1月9日的酒样，TC＋TS处理Cy含量最低，显著低于CK和TC处理，仅为1.47 mg·L-1。TS处理中Mv-acet含量显著高于TS＋TC处理，但TS与其它另外两处理差异不显著。TS处理中tPn-coum含量为3.01 mg·L-1，较CK高出26.47%，但其与TC＋TS处理之间差异不显著。TS处理的tMv-coum含量显著高于TC处理，但与另外两个处理之间差异不显著。各处理之间的Dp、Pt、Pn、Mv和Pn-acet含量均无显著性差异。
综上分析，添加Tannin VR Supra（TS）对葡萄酒中的单体花色苷Dp、Pt、Mv、tPn-coum、tMv-coum含量影响显著。
2.5 添加外源单宁对葡萄酒缩合单宁特性的影响
由图1可知，加入TS进行冷浸渍48 h后，TS处理葡萄醪延伸亚基含量与CK无显著性差异。TS处理末端亚基C为18.61%，较CK低3.82个百分点，而末端亚基EC和ECG与CK差异性不显著。TS处理缩合单宁平均聚合度、分子量和含量分别较CK显著高0.5、156.27 g·mol-1、72.34 mg·L-1。
图1 添加外源单宁对‘赤霞珠’葡萄酒缩合单宁特性的影响Figure 1 Influence of exogenoustannins on the condensation tannin characteristics of wine
从不同组分随葡萄酒陈酿时间延长的变化结果来看，缩合单宁组分中EC-E（EC延伸亚基）和EC-T（EC末端亚基）所占比例在陈酿过程中呈下降趋势，在11月下降至最小值，随后基本维持稳定；
缩合单宁组分中EGC-E（EGC延伸亚基），C-T（C末端亚基）和ECG-T（ECG末端亚基）所占比例在陈酿过程中呈先上升后逐渐稳定的状态。具体而言，EC-E在冷浸渍后含量最高，随后在添加TS、TC和TS＋TC处理中均呈下降趋势，降至39.07%左右后保持稳定。EC-E在TS＋TC处理中的含量显著高于TS和TC处理。EGC-E陈酿过程中呈上升趋势，12月后EGC-E稍有降低，但各处理间差异不显著。C-E（C延伸亚基）在陈酿过程中波动较小，并在添加TC后出现明显降低的趋势。C-T所占百分比随时间变化呈现先下降再上升、再下降再上升的趋势，始终维持在16.85%～26.91%的范围内波动。ECG-T所占百分比随时间变化呈现下降趋势，且在次年1月下降至最小值，所占百分比在0.97%～4.07%。EC-T所占百分比从冷浸渍后到12月间呈现上升趋势，升至19.53%后保持稳定。
缩合单宁平均聚合度和分子量在葡萄酒发酵和陈酿过程中的变化趋势一致，二者在葡萄酒陈酿过程中均表现出轻微降低趋势，并趋于平稳。TS和TS+TC处理较CK显著提高了单宁平均聚合度和分子量，但随着陈酿时间的延长各处理间差异不显著。葡萄酒陈酿过程中各处理缩合单宁含量显著增高。添加TS显著提高了缩合单宁含量，而TS＋TC处理则显著降低了缩合单宁含量。
2019年11月1日的酒样中，TC处理延伸亚基EC和C含量较CK显著高1.06个百分点和1.78个百分点。葡萄酒陈酿过程中，TS、TC和TS＋TC处理EC的占比随陈酿时间延长逐渐升高；
而2020年1月9日的酒样中TS和TC处理缩合单宁延长端EGC的差异不显著。对于三种末端亚基C、ECG和EC，葡萄酒陈酿过程中末端亚基C和ECG变化趋势一致。陈酿至2020年1月9日，各处理与CK之间均无显著性差异。此外，TS处理缩合单宁含量较CK显著增高175.11 mg·L-1，而TS＋TC处理较CK显著降低173.03 mg·L-1。各处理与CK相比，平均聚合度和缩合单宁分子量的差异均不显著。
在新鲜的红葡萄酒中，游离花色苷是主要呈色物质，而这些游离花色苷受酿造工艺以及外界环境变化影响较大[16]。研究表明，酒中花色苷在浸渍发酵过程中在第2～3天达到最大值，随后又逐渐降低[17]。本文中TS处理花色苷含量在酒精发酵后期和浸渍阶段下降速度高于CK，尤其是二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰)-葡萄糖苷。这可能是因为TS添加后与葡萄酒中的蛋白质发生了结合，抑制了酒中单宁与蛋白质的结合，从而使葡萄酒中更多的单宁与花色苷结合，这与曲一鸣等人的研究结果一致[19]。Eglimon等[19]的研究也证实了大部分源于缩合单宁和花色苷的色素聚合物是在酒精发酵期间所形成，苹果酸-乳酸发酵完成后，有色聚合物在红葡萄酒中的含量没有改变。陈酿3个月后，即本研究2020年1月的取样各处理与对照相比，花色苷含量无显著性差异，该结果表明，虽然在外源单宁加入早期对葡萄酒中花色苷含量有显著影响，但随着陈酿时间的延长，影响逐渐消失，也说明在发酵阶段添加外源单宁对单体花色苷的长期作用影响不大。因此，本试验结果表明，在酒精发酵前添加TS可以在发酵初期显著降低花色苷的损失速度，使得单宁可以与更多花色苷相结合而形成稳定的色素聚合物。
添加TC与TS＋TC处理葡萄酒中花色苷含量显著低于对照组，这可能是由于添加TC后，通过乙醛作为媒介，使儿茶酚单宁和色素物质形成稳定的共价键，降低了花色苷含量，从而使葡萄酒的颜色更加深厚并持久，达到稳定色素的效果。这表明水解单宁不参与花色苷的缩合反应，但参与辅色反应和保护花色苷免受氧化。但也有研究认为，在酒精发酵期间添加TC可使缩合单宁与更多花色苷结合，从而形成单宁-花色苷聚合物，有助于葡萄酒颜色保持稳定[4]。
酿酒葡萄的果皮、种子和果梗中富含缩合单宁，且这些缩合单宁可通过葡萄发酵过程被萃取到葡萄酒中。前人的研究明确了缩合单宁对葡萄酒的感官收敛性和颜色稳定性起重要的作用，其结构和组成特性差异可影响葡萄酒收敛性和陈酿潜力[20]。本研究结果发现，在添加TS一定时间后，葡萄酒中缩合单宁含量、平均聚合度及分子量都显著高于对照组，这表明添加TS可以显著降低葡萄酒中缩合单宁的消耗。之前也有研究提出外源单宁能够快速与果汁中的蛋白质反应形成沉淀，避免了果皮中的有益色素、单宁和蛋白质发生沉淀[7-8]。因此本试验在酒精发酵前添加TS可以显著降低葡萄酒中缩合单宁的消耗，有助于单宁-花色苷色素聚合物的形成，使葡萄酒的颜色能以稳定的状态长期保持，这与曲一鸣等[20]的研究成果一致。TC处理与TS＋TC处理在添加TC后缩合单宁分子的平均聚合度与分子量都无显著性差异，表明添加水解单宁不会改变葡萄酒中缩合单宁的平均聚合度和分子量，可能是因为外源单宁可临时抑制氧化而不能提高聚合度。
综上所述，添加TS对葡萄醪花色苷的影响不显著，但显著提高了缩合单宁的平均聚合度、分子量和含量，降低了末端亚基儿茶素的含量。酒精发酵期间，添加TS显著提高了陈酿过程中葡萄酒的单宁含量；
添加TS＋TC显著提高了葡萄酒中各甲基花青素的含量，降低了花青素-3-O-葡萄糖苷和单宁的含量，有利于葡萄酒颜色长期保持稳定；
添加两种外源单宁对葡萄酒缩合单宁聚合度和分子量无显著影响。因此，添加TS可提高葡萄酒缩合单宁特性，添加TS＋TC可提高葡萄酒颜色稳定性。
——“单宁”山东国资(2020年6期)2020-07-09黑曲霉WB－1固态发酵产单宁酶的研究化学与生物工程(2015年1期)2015-12-28香蕉皮单宁的提取工艺研究应用化工(2014年11期)2014-08-16微生物单宁酶研究现状微生物学杂志(2013年1期)2013-07-23西北地区赤霞珠葡萄根际土壤中AM真菌的多样性植物营养与肥料学报(2012年1期)2012-10-26
