马 波，陶 震，周 瑞，王 雪，吕茜茜，孙士红，王 寒，高金秋，张楚涵，陈凤清，*
(1.白城医学高等专科学校 基础医学院，吉林 白城 137000；
2.白城师范学院 生命科学学院，吉林 白城 137000)
花叶万年青(DieffenbachiapictaLodd)也称黛粉叶，为常绿灌木状草本植物，属于天南星科(Araceae)花叶万年青属(Dieffenbachia)。天南星科植物多为药用植物[1]，含有大量生物碱、总黄酮、氨基酸、甾醇类等多种天然产物[2]，其中，生物碱类成分具有杀虫、杀菌作用，植物多糖具有多种药理活性，如抗氧化、抗炎性反应、增强免疫等[3]。
使用化学农药可导致病虫害抗药性和环境污染等一些问题，也将威胁到人类健康。因此，利用植物功能成分研制新型抗菌剂、杀虫剂，开发绿色农药具有重要意义。生物碱是植物中重要的生物活性物质之一，目前已报道了多种植物的生物碱提取条件[4]。天南星科中的很多植物为中国传统中药，且分布广泛，但对其资源的研究与开发力度比较薄弱。目前对天南星科植物的化学成分研究主要集中在天南星属、半夏属和菖蒲属，但发现的生物碱仅70余个。生物碱作为一类具有较高价值的药用成分，现阶段的研究成果显然不能充分发挥其药用价值。前人对花叶万年青的研究多集中于栽培、繁殖、观赏等方面[1]，而对其生物碱提取及其活性研究则未见报道。本文采用超声波乙醇浸提法，通过正交设计优化花叶万年青生物碱提取工艺；
通过杀虫试验，初步研究花叶万年青生物碱对3种供试害虫的杀灭作用；
通过抑菌试验，研究花叶万年青生物碱对7种供试菌种的抑菌活性，旨在为植物源杀虫剂的开发与研制提供理论依据。
植物多糖具有多种活性作用，如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节、清除自由基等[5-7]。目前天南星科植物水溶性多糖的研究多见于芋头[8]、半夏[9-10]、石菖蒲等植物，对花叶万年青可溶性多糖生物活性的研究尚未见文献报道。本文通过自由基清除法试验和Fe3+还原性试验，研究花叶万年青多糖的抗氧化活性，以期为开发花叶万年青多糖的药用价值提供科学参考。
1.1 材料与仪器
花叶万年青为实验室栽种。菌种有大肠埃希菌(Escherichiacoli)(CMCC44103)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(CMCC26003)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(CMCC10104)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(CMCC63501)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysentery)(CMCC51105)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(CMCC50071)，购于中国医学菌种保藏中心(CMCC)，于实验室低温保藏。试验用虫有棉铃虫(Helicoverpaarmigera)(4龄幼虫)、小菜夜蛾(Plutellaxylostella)(3龄幼虫)、大麦虫(Zophobasatratus)(30日龄)，购于活体昆虫专业供应商河南省济源白云实业有限公司。
仪器主要有酶标测试仪(伯爵ELX800)、超声波清洗仪(深华泰PS-100A)、紫外分光光度计(岛津UVmini-1240)、旋转蒸发仪RF52-2(上海沪西分析仪器有限公司)等。
1.2 试验方法
1.2.1 试材处理
室内盆栽：从花叶万年青植株上选取无病虫害、长40 cm以上、带有3或4片舒展叶的分枝，移至装有校园内树林土的花盆中，每盆1株，若干盆，常规管理。待株高长至80 cm以上时，以方便取材的叶做为试材，收集枯老叶片，于50～60 ℃烘干，粉碎。
1.2.2 多糖提取的单因素与正交试验设计
采用苯酚-硫酸法[7]制作标准曲线。标准曲线方程为：葡萄糖质量c(mg)=2.985 5×D485-0.042，R2=0.999 3。
以料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g·mL-1)、提取时间(1、1.5、2、2.5、3 h)、提取温度(75、80、85、90、95 ℃)、提取次数(1、2、3次)为研究对象，依次考察各因素不同水平下花叶万年青多糖得率。多糖得率(mg·g-1)=提取液中多糖含量/样品质量。
根据单因素试验结果，按照4因素3水平，采用L9(34)正交试验法优化花叶万年青多糖提取工艺，因素水平见表1。通过稳定性试验、精密度试验和加标回收率试验，验证正交优化结果的可行性。
表1 多糖提取的正交试验因素水平表
1.2.3 生物碱提取的单因素与正交优化试验
参照文献[11]改进生物碱薄层层析方法，以盐酸小檗碱为标准品，验证生物碱存在。
采用溴甲酚绿法[12]，以盐酸小檗碱为对照品，制作生物碱标准曲线。所得标准曲线方程为：盐酸小檗碱质量c(μg)=192.55×D417+1.010 1，R2=0.999 4。
以料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 mL·g-1)、超声时间(40、60、80、100、120 min)、超声温度(50、58、66、74、80 ℃)、乙醇体积分数(75%、80%、85%、90%、95%)为研究对象，依次考察各因素不同水平下花叶万年青生物碱得率。其中，生物碱得率(mg·g-1)=提取液中生物碱含量/样品质量。
根据单因素试验结果，按照4因素3水平，采用L9(34)正交试验设计法优化花叶万年青生物碱提取工艺，因素水平见表2。
表2 生物碱提取的正交试验因素水平表
1.2.4 多糖提取物抗氧化活性探究
将多糖提取液旋转蒸发、烘干后得到粗多糖粉末，分别称取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g粗多糖粉末，用80%乙醇溶解并定容至100 mL，分别得1、2、3、4、5 g·L-1(按标准曲线计算，相当于多糖浓度分别为0.862、1.724、2.585、3.447、4.309 g·L-1)粗多糖溶液。
以维生素C(VC)为对照，分别研究花叶万年青多糖清除ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基(·OH)作用及对Fe3+还原能力的影响。清除ABTS自由基测定方法参照文献[13-16]，清除DPPH自由基测定方法参照文献[14-15]，清除羟基自由基(·OH)测定方法参照文献[15]，Fe3+还原能力测定方法参照文献[16-17]。
1.2.5 生物碱提取物杀虫作用
将生物碱提取液旋转蒸发后得到生物碱提取物浸膏，分别称取1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 g生物碱提取物浸膏溶于20 mL杀虫液溶剂(吸取50 μL吐温80和50 μL 95%乙醇，用蒸馏水定容至100 mL[18])，分别得55、60、65、70、75、80 mg·mL-1(按照标准曲线计算，相当于生物碱浓度分别为0.635、0.692、0.750、0.808、0.866、0.923 mg·mL-1)生物碱杀虫试液。
以生物碱杀虫死亡率为考察指标，采用均匀设计法实施杀虫试验，试验设计见表3。对于几种试验虫，按虫体浸渍法，每次处理30头，在12、24、36 h统计死亡数量，计算死亡率。虫体死亡率(%)=(总死亡个数/总虫数)×100[18-19]。
表3 均匀设计表
1.2.6 生物碱提取物抑菌活性
将生物碱提取液旋转蒸发后得到生物碱提取物浸膏，精确称取0.125 g生物碱提取物浸膏，用80%乙醇溶解，定容至10 mL，制成12.5 g·L-1(根据标准曲线计算，相当于生物碱浓度为0.144 g·L-1)生物碱提取液。
采用10倍稀释法制备菌悬液，用滤纸片法进行病原细菌的抑制试验。通过抑菌圈直径(d)来判定菌种对生物碱提取物的敏感程度：d<8 mm为不敏感或敏感度不明显；
8 mm≤d<10 mm为低度敏感；
10 mm≤d<15 mm为中度敏感；
15 mm≤d<20 mm为高度敏感；
d≥20 mm为极度敏感[20]。
1.3 数据处理
每项试验设置3个重复，用SPSS 26.0软件处理数据，用Excel 2010软件作图，采用邓肯多重比较法(Duncan’s multiple-range)对数据进行差异性分析，显著性水平为α=0.05。
2.1 花叶万年青多糖提取结果
2.1.1 单因素试验结果
由图1可知，提取温度、时间、料液比和提取次数均对花叶万年青多糖得率有不同程度的影响。根据单因素试验结果，适宜的温度范围为85～95 ℃，提取时间为1～3 h，料液比为1∶30～1∶40 (g·mL-1)，提取次数为1～3次；
较佳单因素水平为提取温度90 ℃、提取时间1.5 h、料液比1∶35 (g·mL-1)、提取次数2次。
图1 提取时间、提取温度、料液比、提取次数对花叶万年青多糖提取的影响Fig.1 Effect of extraction time， extraction temperature， solid-liquid ratio and extraction times on the extraction of polysaccharide from D. picta
2.1.2 花叶万年青多糖提取正交优化试验结果
结合表4和表5可知，各因素对花叶万年青多糖得率的影响大小为料液比>提取次数>提取时间>提取温度，最优组合为A2B1C1D3，即花叶万年青多糖提取较佳工艺为提取温度90 ℃，提取时间1 h，料液比1∶30 (g·mL-1)，提取3次。
表4 花叶万年青多糖提取正交试验设计方案与结果
表5 极差分析结果
多重比较结果表明，4个因素的3个水平之间差异不显著(P>0.05)，因此，如果综合试验成本考虑，将多糖提取最佳工艺确定为提取温度85 ℃，提取时间1 h，料液比1∶30 (g·mL-1)，提取1次。
多糖得率的精密度实验结果(表6)显示，相对标准偏差(RSD)为0.3%，表明优化的提取方案精密度良好。多糖得率的稳定性试验结果(表7)显示，RSD为0.2%，表明样品的稳定性较好。加标回收率试验结果显示，各部位回收率均在80%以上。优化工艺条件方法学考察试验结果表明，此工艺参数可靠、稳定。
2.2 花叶万年青生物碱提取结果
2.2.1 单因素试验结果
提取料液比、超声时间、超声温度和乙醇体积分数均对花叶万年青生物碱得率有不同程度的影响，根据单因素试验结果(图3)，认为适宜的料液比范围为1∶20～1∶40 (g·mL-1)，超声时间为40～120 min，超声温度为50～80 ℃，乙醇体积分数为75%～95%；
较佳单因素水平为料液比1∶35 (g·mL-1)、超声时间60 min、超声温度66 ℃、乙醇体积分数95%。
2.2.2 正交试验优化结果
结合表8和9，各因素对花叶万年青生物碱得率的影响大小为超声温度>超声时间>料液比>乙醇体积分数，设计正交试验最优组合为A1B3C2D2，即花叶万年青叶生物碱提取较佳工艺为料液比1∶30 (g·mL-1)，超声时间80 min，超声温度66 ℃，乙醇体积分数90%。多重比较结果显示，液料比、超声时间和乙醇体积分数的3个水平之间差异不显著(P>0.05)；
超声温度的3个水平之间差异均显著(P<0.05)，如果考虑试验成本，建议生物碱提取最佳工艺为超声温度66 ℃，超声时间40 min，料液比1∶30 (g·mL-1)，乙醇体积分数85%。
由表6和表7可知，精密度试验RSD为1.1%，表明方法精密度良好；
稳定性试验结果的RSD为0.2%，表明样品的稳定性较好。加标回收率试验结果(图4)显示，回收率均在80%以上。说明优化的工艺参数可靠、方法可行。
表6 花叶万年青提取多糖和生物碱的精密度
表7 花叶万年青多糖和生物碱提取的稳定性
图2 多糖加标回收率Fig.2 Recovery rate of polysaccharide
2.3 花叶万年青功能成分的生物活性
2.3.1 多糖的抗氧化活性
花叶万年青多糖抗氧化活性主要有多糖对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基清除清除率，以及对Fe3+还原能力的影响。由图5-A可知，花叶万年青多糖对DPPH自由基有一定的清除能力，随着花叶万年青多糖质量浓度的升高，自由基清除率均增加。花叶万年青多糖清除DPPH自由基的半抑制浓度(IC50)为4.994 mg·mL-1，VC清除DPPH自由基的IC50为2.216 mg·mL-1，花叶万年青多糖IC50大于VC的IC50，说明花叶万年青多糖清除DPPH自由基能力弱于VC。
图3 料液比、超声时间、超声温度与乙醇体积分数对花叶万年青生物碱提取的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic temperature and ethanol volume fraction on extraction of alkaloids from D. picta
表8 花叶万年青叶部位生物碱提取正交试验设计方案与结果
表9 极差分析结果
图4 生物碱加标回收率试验结果Fig.4 Recovery rate of alkaloid
由图5-B可知，花叶万年青多糖质量浓度为0～5.0 mg·mL-1时，对ABTS自由基清除率表现出浓度依赖性；
即随着多糖质量浓度的升高，其ABTS自由基清除率逐渐升高。在5.0 mg·mL-1时，花叶万年青多糖的自由基清除率达到48.60%。与玉竹多糖[21]相比，花叶万年青多糖具有更强的ABTS自由基清除能力。花叶万年青多糖清除ABTS自由基的IC50为7.75 mg·mL-1，VC清除ABTS自由基的IC50为2.708 mg·mL-1，花叶万年青多糖IC50大于VC的IC50，说明花叶万年青多糖清除ABTS自由基能力弱于VC。
由图5-C可知，随着花叶万年青多糖质量浓度的增加，其对羟基自由基的清除率增大。在5.0 mg·mL-1时，花叶万年青多糖对羟基自由基的清除率达到40.86%；
多糖浓度为2.0 mg·mL-1时，对羟基自由基的清除率与VC相近。与白鲜皮多糖抗氧化能力[22]相比，花叶万年青多糖具有较好的抗氧化能力。但与山竹果皮多糖[23]相比，其对羟基自由基清除率较低。花叶万年青多糖清除羟基自由基的IC50为24.063 mg·mL-1，VC清除羟基自由基的IC50为5.853 mg·mL-1，花叶万年青多糖IC50大于VC的IC50，说明花叶万年青多糖清除羟基自由基能力弱于VC。
由图5-D可知，相同浓度下花叶万年青多糖的铁还原力低于VC。花叶万年青多糖浓度达到5 mg·mL-1时，吸光度D700为0.338 6，表明花叶万年青具有较强的抗氧化性。花叶万年青多糖质量浓度为1～3 mg·mL-1时，铁还原力能力与花叶万年青多糖的质量浓度呈线性关系。与南瓜籽多糖[24]相比，花叶万年青多糖的抗氧化性较弱。
A，DPPH自由基清除能力；
B，ABTS自由基清除能力；
C，羟基自由基清除能力；
D，对Fe3+还原能力。A， DPPH free radical scavenging ability；
B， ABTS free radical scavenging ability；
C， Scavenging ability on hydroxyl radical；
D， Fe3+ reduction ability.图5 花叶万年青多糖抗氧化活性Fig.5 Antioxidant activity of polysaccharide from D. picta
2.3.2 生物碱的杀虫作用
由表10可知，花叶万年青生物碱提取物对3种试验虫的触杀效果较好，棉铃虫在浸渍处理36 h后死亡率最高可达92.22%，虫体死亡率随观察时间的延长而增加，触杀效果为36 h(组合4除外)高于24 h和12 h。多重比较结果表明，棉铃虫在浸渍36 h后，组合1、2、3、5和6之间差异不显著(P>0.05)，组合4与其他组合之间差异显著(P<0.05)。小菜夜蛾在浸渍处理36 h后，死亡率最高可达96.67%，组合2和组合6之间差异不显著(P>0.05)，组合1和组合3之间差异不显著(P>0.05)，组合4和组合5之间差异不显著(P>0.05)，其余组合之间差异显著(P<0.05)，表明不同试验组合对小菜夜蛾的触杀效果不尽相同。大麦虫在浸渍处理36 h后的死亡率最高可达96.67%；
在相同观察时间下，不同试验条件下大麦虫死亡率不同。
2.3.3 生物碱的抑菌作用
12.5 mg·mL-1生物碱提取物对不同菌的抑制效果有所不同，大肠埃希菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺氏菌的抑菌圈直径分别为10.95、8.00、8.20、8.85、7.05、10.67、8.25 mm，说明12.5 mg·mL-1生物碱提取物对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌抑菌活性最强，其次是粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌，而伤寒沙门氏菌表现出不敏感或敏感度不明显。
表10 花叶万年青生物碱杀虫试验结果
本文通过单因素试验和正交试验，优化了花叶万年青叶片多糖和生物碱的提取工艺，多糖最佳提取条件为料液比1∶30 (g·mL-1)，提取次数3次，提取时间1 h，提取温度90 ℃；
生物碱的最佳提取条件为超声温度66 ℃，超声时间80 min，料液比1∶30 (g·mL-1)，乙醇体积分数90%。抗氧化试验结果表明，花叶万年青多糖有显著的体外抗氧化活性，对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基有明显的清除作用，其IC50分别为4.994、7.75和24.063 mg·mL-1，均大于相应对照物VC的IC50；
花叶万年青多糖对Fe3+有还原作用，其机制有待于进一步研究。
花叶万年青生物碱对大麦虫、小菜夜蛾和棉铃虫均有很强的触杀作用。浸渍次数1次、浸渍时间4 s、浸渍液浓度24 mg·mL-1、培养温度65 ℃条件下对棉铃虫浸渍后36 h死亡率可达92.22%；
浸渍次数6次、浸渍时间10 s、浸渍液浓度4 mg·mL-1培养温度70 ℃条件下对小菜夜蛾和大麦虫浸渍后36 h死亡率均可达96.67%。抑菌试验结果显示，花叶万年青生物碱对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌抑菌活性最强，其次是粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌，而对伤寒沙门氏菌表现出不敏感或敏感度不明显。提示花叶万年青在植物病虫害的防治上具有较好的应用前景，可为花叶万年青资源的深入开发和利用提供依据，同时为新农药研制提供一定的科学参考。
